一种内生真菌多量毛霉及其应用

本发明属于微生物技术应用领域，具体涉及一种天麻内生菌多量毛霉(mucorabundans)及其应用于高效转化三七总皂苷(人参皂苷rb1、rd、re、rg1、rb2、rc、rb3、三七皂苷r1)为小极性人参皂苷。

背景技术：

1、三七(panax notoginseng(burk.)f.h.chen)为五加科人参属植物。主要产于云南、广西、四川等地。三七主要的活性成分是皂苷类成分，皂苷是由苷元和各种糖基组成的糖苷类化合物，三七中的皂苷类成分大多数为达玛烷型皂苷。三七根中总皂苷含量高达8～12％，以人参三醇型皂苷为主，其中人参皂苷rg1、rb1、rd、re和三七皂苷r1含量最高，约占三七根中总皂苷含量的80％。三七花的总皂苷是三七植株中皂苷含量最高的部位，以人参二醇型皂苷为主，其中三七花中主要人参皂苷包括人参皂苷rb1、rb2、rc、rb3、rd。三七主根及花中天然皂苷都因其母核侧链上连接有不同种类和数量的糖基，而表现出较大的极性。研究表明，较大极性皂苷(天然皂苷)在肠内吸收较差，而小极性人参皂苷(稀有人参皂苷)很容易从胃肠道吸收到血液中，作为活性化合物发挥作用。因此通过体外转化促进天然人参皂苷转化为小极性人参皂苷的方法备受人们关注。

2、大量研究表明，稀有人参皂苷具有更高的药理活性。例如，研究证实人参皂苷rk1通过协调端粒酶活性的抑制和细胞凋亡的诱导之间的机制，从而对肝癌hepg2细胞具有抗癌作用。rg6是一种次要人参皂苷，通过诱导白介素-10和microrna-146a抑制全身炎症。人参皂苷rd2通过调节p2y12下游的信号通路，有效地减弱血小板功能从而可以预防血栓性疾病；三七皂苷fe可以治疗心脑血管疾病和抑制食源性肥胖。人参皂苷rk3通过调节pi3k/akt/mtor通路介导细胞凋亡和自噬，在体内发挥抗食管癌活性。人参皂苷rh4可以通过抑制jak2/stat3信号抑制肺腺癌转移，也可以抑制癌症细胞增殖。人参皂苷rg3对肺癌细胞a549、黑色素瘤细胞、直肠癌细胞sw480、胆囊癌细胞等具有抑制作用。人参皂苷rh1具有重要的抗炎、抗氧化作用等。

3、目前获得少量人参皂苷的方法主要有物理转化法、化学转化法、生物转化法和人参皂苷克隆酶转化。然而微生物转化法特异性强、条件温和、产物稳定、易分离、环境污染小、转化效率高等多重优势，是目前制备稀有人参皂苷的优选方法之一。

技术实现思路

1、本发明提供一种内生真菌多量毛霉(mucor abundans)及其应用，将内生真菌多量毛霉应用于促进三七总皂苷(人参皂苷rb1、rd、re、rg1、rb2、rc、rb3、三七皂苷r1)高效转化为小极性人参皂苷，具有转化工艺简单，作用底物多样，转化产物丰富，制备成本低，无环境污染等优势。

2、本发明多量毛霉(mucor abundans)属于真菌界(fungi)，毛霉门(mucoromycota)，藻状菌纲(mucoromycetes)，毛霉目(mucorales)，毛霉科(mucoraceae)，毛霉属(mucor)，分离自新鲜天麻。

3、本发明多量毛霉(mucor abundans)t63，基因序列已提交至ncbi数据库，并通过其中的bankit工具申请到genbank登录号为oq781160，利用软件mega6构建系统发育树，并结合菌落形态观察及菌丝显微形态观察确定t63为多量毛霉(mucor abundans)。

4、本发明多量毛霉(mucor abundans)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.40620，保藏日期为2023年5月9日。

5、本发明内生真菌多量毛霉高效转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的方法，具体步骤为：

6、(1)pdb液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/l、葡萄糖20g/l，自然ph，在101kpa、121℃灭菌30min备用；

7、(2)采用步骤(1)制备的pdb培养基活化培养2～7d内生菌多量毛霉菌；

8、(3)吸取步骤(2)活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的pdb液体培养基中，接种的菌悬液体积是培养液体积的0.1～10.0％，室温，摇床无菌培养7～14d；

9、(4)底物添加：按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:2～1:10的比例，乙醇溶液的体积百分比浓度为70～80％，将三七总皂苷与乙醇溶液混合得到三七总皂苷溶液，在无菌条件下将三七总皂苷溶液添加至步骤(3)培养结束后的菌液中，继续摇床培养7～21d，其中三七总皂苷溶液的添加量为菌液质量的0.02～2.00％；

10、(5)发酵结束后，采用纱布过滤掉菌体，发酵液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的小极性人参皂苷。

11、本发明内生真菌多量毛霉高效转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的方法，具体步骤为：

12、(1)pdb液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/l、葡萄糖20g/l，自然ph，在101kpa、121℃灭菌30min备用；

13、(2)采用步骤(1)制备的pdb培养基活化培养2～7d内生真菌多量毛霉菌；

14、(3)吸取步骤(2)活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的pdb液体培养基中，接种的菌悬液体积是培养液体积的0.1～10.0％，室温，摇床无菌培养7～14d；

15、(4)将步骤(3)培养完毕的菌株用硫酸铵盐析，硫酸铵添加饱和度为60～85％；4000～12000r/min离心10～20min分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加0.1～1l的ph值为3.5～5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的比例漩涡震荡溶解粗酶沉淀；4000～12000r/min离心5～10min除去不溶物即得粗酶溶液；

16、(5)采用体积百分比浓度为70～80％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4～1:20，溶解后在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(4)的粗酶溶液中，继续培养1～4d，其中三七总皂苷溶液的添加量为粗酶溶液质量的0.02～2.00％；

17、(6)培养结束后，培养液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的小极性人参皂苷。

18、本发明内生真菌多量毛霉高效转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的方法，具体步骤为：

19、(1)采用体积百分比为70～80％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，得到终浓度为0.1～1mg/ml三七总皂苷溶液；

20、(2)利用上述粗酶溶液与步骤(1)中三七总皂苷溶液混合反应，三七总皂苷溶液与粗酶溶液的质量比为1:2～1:20，温度为50～60℃，ph值为3.5～5.0，反应4～72h；

21、(3)步骤(2)反应结束后加入水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得三七总皂苷转化后的小极性人参皂苷。

22、所述三七总皂苷包括人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc、rd、rg1、re、三七皂苷r1中的一种或多种混合；所述三七总皂苷可以为三七主根及三七花的乙醇提取物，其主根总皂苷主要含有人参皂苷rb1、rd、rg1、re和三七皂苷r1，花总皂苷主要含有主要人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc和rd。

23、所述小极性人参皂苷为20(s)-r2、20(r)-r2、20(r)-rh1、20(s)-rh1、20(s)-rg2、20(r)-rg2、20(r)-rh2、20(s)-rh2、f2、rk3、t5、rh4、f4、rg6、20(s)-rg3、20(r)-rg3、rg5、rk1、fe(c-mc1)、rd2(c-o)、fd(c-mx1)、ck中的多种混合。

24、本发明的有益效果：

25、本发明首次发现多量毛霉菌具有从三七中生产小极性人参皂苷的能力，具有高效、简便、环保等优点，这一发现将有助于提高三七的药用功能和经济价值。