基于CXCR的信号转换受体的制作方法

本发明涉及生物，具体地涉及一种信号转换受体及其用途。

背景技术：

1、针对免疫效应细胞负调控的抑制性信号通路在近年已经有多项报道将其相应受体的胞外区与正向共刺激信号分子的跨膜区与胞内区连接，构建得到新的融合受体，这类融合受体在免疫效应细胞中表达后起到信号转换器的功能，可将肿瘤微环境内免疫抑制信号转换为免疫激活信号，即该信号转换分子胞外多肽接收肿瘤细胞表面、肿瘤基质细胞表面或肿瘤微环境中的免疫抑制分子信号并传递到胞内，通过共刺激信号分子胞内段激活免疫细胞的第二信号，进而增强免疫效应细胞的增殖与细胞因子分泌功能，延长活化免疫效应细胞的存活时间。

2、长期的慢性炎症是肿瘤发生的标志之一。对肿瘤微环境中众多细胞因子的炎症应答在促进肿瘤生长、进展和免疫抑制中扮演了关键作用。il-8(cxcl8)是一类属于cxc家族的趋化因子，负责炎症部位粒细胞的招募和激活。在生理条件下，il-8的分泌基本检测不到，在促炎症因子如tnf-α、il-1β存在时分泌会被迅速诱导上升。il-8通过与其相对应的受体cxcr1和cxcr2相结合发挥生物学功能。il-8与cxcr1结合主要效应为增加肿瘤细胞增殖，而与cxcr2结合在某些癌症(如前列腺癌)中促进了血管形成。高水平的il-8往往预示着患癌几率增加的风险和疾病的不良预后。cxcr1和cxcr2在粒细胞、单核细胞、巨细胞和某些nk细胞上表达。

3、为刺激免疫效应细胞的增殖和提升其肿瘤免疫的效果，需要降低il-8/cxcr1/2信号轴心对肿瘤生长的促进作用以及对免疫微环境的抑制，目前仍然需要更多的包括信号转换器分子在内的手段对免疫效应细胞进行改造和激活。已有报道表明，在黑色素瘤来源的til中具有肿瘤趋向性的til细胞群内cxcr1和cxcr2阳性的细胞比例与不具有肿瘤趋向性的til细胞群相比明显更高。当在til中过电转cxcr1 mrna后，表达cxcr1的til肿瘤趋向水平与对照til相比仍然高23％(sapoznik s,ortenberg r,galore-haskel g,kozlovski s,levy d,avivi c,et al.cxcr1 as a novel target for directing reactive t cellstoward melanoma:implications for adoptive cell transfer immunotherapy.cancerimmunol immunother(2012)61(10):1833–47)。但上述均为免疫效应细胞中直接表达cxcr1/2，而目前仍未见基于将趋化因子受体cxcr1/2介导的抑制性信号转换为激活信号的信号转换受体。

技术实现思路

1、本发明提供一种分离的融合蛋白，其为信号转换受体，包含：cxcr区和胞内区，所述cxcr区是cxcr或其含有胞外区和跨膜区的片段或突变体，所述胞内区包含共刺激信号分子的胞内结构域或其保留了共刺激信号分子传递共刺激信号、活化免疫细胞的生物学功能的功能片段或突变体。在一个或多个实施方案中，cxcr区位于胞内区的n端方向。

2、在一个或多个实施方案中，cxcr是cxcr1或cxcr2。所述cxcr1的氨基酸序列为seqid no:4。

3、在一些实施方案中，所述cxcr区与所述胞内区之间还具有接头。优选地，所述接头的氨基酸序列如seq id no:14、16、18或20所示。更优选地，所述接头的氨基酸序列如seqid no:14、16或20所示。

4、在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子包括cd28、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、lck、icos、dap10、siglec-9、siglec-10、siglec-15、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、il-2r、il-4r、il-7r、il-10r、il-12r、il-15r、il-21r、cd27和cd40中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子包括cd28和/或il-7ralpha。

5、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含cxcr1或cxcr2或其突变体，和胞内区，所述胞内区包括选自以下的一种或多种共刺激信号分子胞内结构域：cd28胞内区、il-7ralpha胞内区、cd134胞内区、cd137胞内区、il-2rbeta胞内区、il-4rbeta胞内区、il-7ralpha胞内区、il-10ralpha胞内区、il-12rbeta胞内区、il-15ralpha胞内区、il-21ralpha胞内区、cd27胞内区、cd40胞内区。

6、在一个或多个实施方案中，所述cd28胞内区的氨基酸序列如seq id no:6所示。

7、在一个或多个实施方案中，所述il-7ralpha胞内区的氨基酸序列如seq id no:8所示。

8、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括膜表面标签。优选地，膜表面标签位于cxcr区的n端。

9、在一些实施方案中，所述的cxcr区与膜表面标签之间还具有接头。在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签包括膜表面功能结构域，其为bcma胞外结构域或其变体，或claudin蛋白胞外结构域或其片段或变体。

10、在一个或多个实施方案中，所述bcma胞外结构域的氨基酸序列如seq id no:10所示；其核酸序列包含seq id no:9所示序列。

11、在一个或多个实施方案中，所述claudin蛋白是claudin18，优选claudin18.2。在一个或多个实施方案中，claudin蛋白胞外结构域的片段是claudin蛋白胞外抗原表位。在一个或多个实施方案中，claudin18.2蛋白胞外结构域的片段包含seq id no:12所示序列；其核酸序列包含seq id no:11所示序列。

12、在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签还包括位于膜表面功能结构域的n端或c端的接头或铰链区。优选地，所述接头如seq id no:14、16、18或20所示。更优选地，所述接头如seq id no:14或18所示。

13、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白为seq id no:21-26中任一项所编码的蛋白。

14、本发明还提供一种多核苷酸分子，选自：编码本发明任一实施方案所述的融合蛋白的多核苷酸分子或互补序列。

15、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，cxcr1的编码序列如seq id no:3所示。

16、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，共刺激信号分子的胞内结构域是cd28胞内区，其编码序列如seq id no:5所示。

17、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，共刺激信号分子的胞内结构域是il-7ralpha胞内区，其编码序列如seq id no:7所示。

18、在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含膜表面标签，所述膜表面标签包含编码序列如seq id no:9所示的bcma胞外结构域或编码序列如seq id no:11所示的claudin18.2蛋白胞外结构域的片段。

19、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸分子选自seq id no:21-26中任一所示，或者为任一所示多核苷酸分子的互补序列。

20、本发明还提供一种核酸构建体，含有本发明任一实施方案所述的多核苷酸分子。

21、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体为载体。

22、在一个或多个实施方案中，所述载体为表达载体或整合载体；优选为病毒载体或非病毒载体，更优选为非病毒载体。

23、本发明还提供一种基因工程化的细胞，其表达本发明任一实施方案所述的融合蛋白，和/或携带所述融合蛋白的编码序列。

24、在一个或多个实施方案中，所述细胞为免疫细胞。

25、在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞包括t细胞、nk细胞、car-t、car-nk、tcr-t、cik、nkt和til。

26、在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达car，或携带car的编码序列。

27、在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达外源tcr，或携带外源tcr的编码序列。

28、本发明还提供药物组合物，包含药学上可接受的辅料或本发明任一实施方案所述的融合蛋白、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞。所述药物组合物用于治疗或预防癌症。

29、在一个或多个实施方案中，所述癌症是黑色素瘤或前列腺癌。

30、本发明还提供本发明任一实施方案所述的融合蛋白、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。

31、本发明优点：

32、首次提供了一种基于cxcr1/2的信号转换受体，能够有效地将il-8介导的免疫抑制信号转换为激活信号，使表达该信号转换受体的免疫效应细胞肿瘤趋向性提升的同时具有更高的活化水平，能更有效地杀伤肿瘤。