基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的间接ELISA检测方法

本发明涉及病毒检测，具体涉及基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的间接elisa检测方法。

背景技术：

1、非洲猪瘟病毒p30蛋白是一种早期表达的膜蛋白，由cp204l基因编码，猪只在感染非洲猪瘟病毒后的3～4h内即产生p30蛋白，并且在感染期间能持续产生，目前作为非洲猪瘟检测靶标物已广泛用于血清学检测中。目前有很多基于p30蛋白的非洲猪瘟elisa检测方法，但是现有非洲猪瘟elisa检测方法存在检测成本高、抗原制备及产率低、不适合大规模生产、检测敏感性低、与商品化非洲猪瘟elisa检测试剂盒的检测符合率低等问题，因此开发一种新的成本低、抗原产率高、敏感性高、特异性好且与商品化elisa检测试剂盒的检测符合率一致的elisa检测产品或方法迫在眉睫。

2、

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的间接elisa检测方法。

2、本发明提供了非洲猪瘟病毒p30蛋白的制备方法，其为将如seq id no:3所示的核苷酸序列构建于真核表达载体，所述真核表达载体转染hek-293f细胞后经培养和纯化，获得p30蛋白。

3、进一步的，所述纯化后还包括浓缩的步骤。

4、本发明中，试验结果证明，p30蛋白在hek-293f细胞表达量高，达到了4.456mg/ml，在其他细胞中表达量显著低于hek-293f细胞(如hek-293t细胞)，并且与其他细胞相比，利用hek-293f细胞对p30蛋白进行表达，步骤简单、成本低，细胞培养和蛋白制备效率高，所产生的p30蛋白与其他细胞表达的p30蛋白相比，进行elisa检测所需的浓度更低，显著降低检测成本。

5、所述seq id no:3所示的核苷酸序列包括kozak序列，kozak序列是在真核生物中起始转译的重要序列，用于提高目的基因的转录和翻译。

6、进一步的，

7、所述真核表达载体为pcmv3；

8、所述提取的溶液为pbs。

9、本发明提供了所述的制备方法制得的p30蛋白。

10、现有的p30蛋白的表达方式主要为原核表达系统，原核表达是指发生在原核生物(主要为大肠杆菌)内的基因表达，该系统的表达产物易形成包涵体、活性较低，表达的蛋白不可溶，在纯化过程中容易造成蛋白失活；此外，由于通过大肠杆菌表达哺乳动物病毒蛋白，与哺乳动物同源性较低，且只可以表达一些无糖基化或者经过简单修饰的重组蛋白。本发明使用哺乳动物真核表达系统进行p30蛋白的表达，能对表达的蛋白进行自我修饰，与哺乳动物同源性好，整个操作过程在无血清培养条件下完成，制备方法简单快速。且本发明对p30蛋白宿主细胞进行了筛选，使用hek-293t细胞，蛋白表达量较低，无法实现大规模生产，使用hek-293f细胞进行p30蛋白的真核表达，结果表明，使用hek-293f细胞可进行p30蛋白的大规模生产，纯化得到的蛋白可达到4.456mg/ml，具有表达量高、具有正确的折叠构象并可以实现大规模生产的优点。

11、将所述制备的p30蛋白应用于非洲猪瘟病毒的间接elisa检测，与现有其他基于p30蛋白的方法相比较，抗原包被浓度可低至0.3μg/ml，降低了抗原的使用量(现有技术使用的抗原包被浓度通常在0.5μg/ml以上，所需抗原量较多)，且敏感性可达到1:12800(商品化试剂盒敏感性为1：6400)，与商品化试剂盒同时检测342份血清样品，符合率高达到100％，在降低成本的同时能应用于临床检测。且相较于其他现有产品，检测时间显著缩短，5min即可显色。

12、本发明提供了制剂，其包括辅料和本发明所述的p30蛋白。

13、本发明所述的制剂，其含有本发明所述的p30蛋白，所述制剂可用于p30蛋白抗体的制备和/或非洲猪瘟病毒检测。

14、本发明中，所述辅料包括佐剂、缓冲液、抗氧化剂，蛋白保护剂等，用于维持所述p30蛋白的活性或使其发挥作用。

15、本发明提供了如下i)～ii)所示中的至少一种在制备非洲猪瘟病毒检测产品中的应用：

16、i)、本发明所述的p30蛋白；

17、ii)、本发明所述的制剂。

18、本发明提供了非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，其包括抗原包被液、血清稀释液和/或封闭液中的至少一种和本发明所述的p30蛋白。

19、进一步的，所述的试剂盒中，

20、所述抗原包被液为碳酸盐缓冲液；

21、所述血清稀释液包括pbs和bsa；

22、所述封闭液包括pbs和bsa。

23、更进一步的，所述的试剂盒中，

24、所述抗原包被液为0.05mmol/l ph为9.6的碳酸盐缓冲液；

25、所述血清稀释液包括pbs和质量分数为1％的bsa；

26、所述封闭液包括pbs和质量分数为2％的bsa。

27、本发明所述的试剂盒中还包括酶标抗体、盐酸和检测耗材等，所述酶标抗体具体的为hrp-山羊抗猪-igg，所述盐酸为1m盐酸。

28、本发明提供了非诊断目的的非洲猪瘟病毒的检测方法，其为利用本发明所述的制剂和/或本发明所述的试剂盒对样本进行检测。

29、进一步的，所述样本为血清。

30、本发明以pcmv3为真核表达载体，构建pcmv3-p30重组质粒，在hek-293f细胞上进行非洲猪瘟病毒p30蛋白的真核表达，并与hek-293t细胞进行对比，结果表明，与hek-293t细胞相比，p30蛋白在hek-293f细胞上表达量高，可以实现p30蛋白的大规模生产，将其应用于非洲猪瘟病毒间接elisa检测中，包被的p30蛋白需求浓度低、显著降低检测成本，检测敏感性高、特异性好，且与商品化elisa检测试剂盒的检测符合率为100％，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.非洲猪瘟病毒p30蛋白的制备方法，其特征在于，将如seq id no:3所示的核苷酸序列构建于真核表达载体，所述真核表达载体转染hek-293f细胞后经培养和纯化，获得p30蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

3.权利要求1或2所述的制备方法制得的p30蛋白。

4.制剂，其特征在于，包括辅料和权利要求3所述的p30蛋白。

5.如下i)～ii)所示中的至少一种在制备非洲猪瘟病毒检测产品中的应用：

6.非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括抗原包被液、血清稀释液和/或封闭液中的至少一种和权利要求3所述的p30蛋白。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，

9.非诊断目的的非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于，为利用权利要求4所述的制剂和/或权利要求6～8任一项所述的试剂盒对样本进行检测。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述样本为血清。

技术总结
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的间接ELISA检测方法。本发明以pCMV3为真核表达载体，构建pCMV3‑p30重组质粒，在HEK‑293F细胞上进行非洲猪瘟病毒p30蛋白的真核表达，并与HEK‑293T细胞进行对比，结果表明，与HEK‑293T细胞相比，p30蛋白在HEK‑293F细胞上表达量高，可以实现p30蛋白的大规模生产，将其应用于非洲猪瘟病毒间接ELISA检测中，包被的p30蛋白需求浓度低、显著降低检测成本，检测敏感性高、特异性好，且与商品化ELISA检测试剂盒的检测符合率为100％，具有广泛的应用前景。

技术研发人员：亓文宝,陈画菡,朱君海,牛学锋,程元艺,黄丽红,高飞,简伟俊
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16