一种适用于杨属不同树种茎的通用内参基因及其筛选方法和应用

本发明涉及分子生物学，特别是涉及一种适用于杨属不同树种茎的通用内参基因及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、rna测序(rna-seq)技术凭借其准确性、灵敏度和分辨率，在转录组学研究中发挥了关键作用。在特定的rna-seq分析中，研究人员通常从不同生物学条件下或在相似条件下重复的样本中提取总rna或特定的rna片段开展基因表达研究。近年来，随着下一代测序(ngs)技术的成本降低和技术进步，rna-seq已成为基因表达研究的首选方法。这种基于序列的方法不仅彻底改变了转录组研究，同时促进了各种新应用的发展，如链特异性表达分析、转录本融合鉴定、选择性剪接异构体以及基因组引导的转录本de novo组装。此外，与微阵列相比，rna-seq是一种更先进的替代方案，能够在不同的生物组织和生长条件下更有效地发现差异表达基因(deg)，并识别具有更高基因组覆盖率的基因(包括弱表达基因)。

2、rna-seq通过计算产生的片段以及特定转录本的读数数量分析转录本丰度。由于特定样本中的总rna含量未知，研究人员可以根据每个样本的总读数数量和转录本长度对rna-seq数据进行归一化，以获得rpkm或fpkm(fragments/reads per kilobase million)值；也可以通过使用不同的归一化方法，如tmm(trimmedmean ofm-values)、deseq2和上四分位数(uq)等，利用所有样本的读数数据进行归一化。

3、rna-seq实验主要用于在特定生物学条件下识别deg。然而，除了deg之外，还有许多在不同细胞或发育阶段中不受环境条件影响的固定表达基因(ceg)。例如，在39种不同的水稻组织中，有22.7％的水稻转录本是由ceg表达的。实时荧光定量pcr(qrt-pcr)是一种可靠的转录本检测和测量技术。根据miqe(minimum information for publication ofquantitative real-time pcr experiments)指南的规定，要获得可靠的qrt-pcr结果，需要选择适当的内参基因(rg)对表达数据进行归一化。rg是在不同的植物组织、发育阶段或生理条件下，表达水平稳定且不受外部处理影响的基因，无需验证其稳定性。然而，在模式植物中对rg的验证和对转录组数据的全面挖掘中发现，内源对照的准确性受到不同植物物种、研究的细胞/组织/器官和生长条件的影响。因此，选择合适的rg对于qrt-pcr表达分析是至关重要的一步，rg选择不当可能导致错误的结果。

4、在许多植物中，人们通常从细胞内的基本代谢基因中选择rg，例如番茄中的glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(gapdh)、橄榄中的α-/β-tubulin、杨树中的actin、矮牵牛中的polyubiquitin(ubq)以及香蕉中的ubiquitin conjugating enzyme(ubc)等。然而，在不同条件和组织类型中，这些基因的表达存在明显的差异。在特定实验条件或组织类型中，最佳rg也可能存在差异。因此，在使用rg对数据进行归一化之前，验证其表达稳定性非常重要。在不同条件或组织中表达变异性最小的基因可被列为潜在的rg候选者。只有那些经过表达稳定性验证的rg候选者才能被称为特定条件或组织类型的rg。bestkeeper、qbaseplus、genorm和normfinder是目前常用的在特定实验条件下寻找最佳候选rg的统计工具。

5、杨树是世界上分布最广泛的树种之一，被大量应用于木材生产、环境保护和城市绿化中。作为一种重要的木本模式植物，杨树的茎生长和发育研究已相当深入，并产生了大量的转录组数据。本发明通过从公共数据库下载并评估不同种杨树的茎组织转录组数据，预测和评估可用于杨树茎组织基因表达分析的最佳候选rg，并通过qrt-pcr验证杨树茎在不同胁迫条件下候选rg的表达稳定性，筛选出杨树茎的通用rg。此外，本发明还基于杨树茎候选rg筛选的案例研究，建立了一个基于rna-seq数据进行不同种杨树rg开发的通用流程，以及适用于在杨属不同树种中设计某一特定内参基因引物的通用方法。本发明对于开展杨树分子生物学研究和生物技术育种具有重要的指导作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种适用于杨属不同树种茎的通用内参基因及其筛选方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明为杨树筛选出3个适用于不同条件下茎的新内参基因，对于开展杨树分子生物学研究和生物技术育种具有重要的指导作用。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种适用于杨属不同树种茎的通用内参基因，包括cnot2、vps35和cul4基因，所述cnot2、vps35和cul4基因的核苷酸序列依次如seq id no：1-3所示。

4、本发明还提供一种用于扩增所述的通用内参基因的引物组，包括：

5、用于扩增所述cnot2基因的引物对，核苷酸序列如seq id no：4-5所示；

6、用于扩增所述vps35基因的引物对，核苷酸序列如seq id no：6-7所示；

7、用于扩增所述cul4基因的引物对，核苷酸序列如seq id no：8-9所示。

8、本发明还提供一种用于扩增所述的通用内参基因的试剂盒，包含所述的引物组。

9、本发明还提供一种所述的通用内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

10、(1)选择杨属不同树种的不同茎部位、不同茎组织、不同发育阶段以及不同胁迫处理的材料构建的rna测序转录组数据，对所述rna测序转录组数据中的基因表达数据进行均一化处理后，筛选cv值≤0.3的基因为候选内参基因；

11、(2)选取不同品种材料进行处理，提取rna，设计候选内参基因的种间通用引物，通过qpcr检测候选内参基因及现有内参基因的表达水平，采用ref-finder算法分析各内参基因在不同处理条件下的表达稳定性，筛选在不同品种材料及不同处理条件下均能稳定表达，且稳定性优于现有内参基因的候选内参基因，即为所述的通用内参基因。

12、本发明还提供一种所述的通用内参基因或所述的引物组或所述的试剂盒或所述的通用内参基因的筛选方法在杨属不同树种茎基因表达分析中的应用。

13、本发明还提供一种所述的通用内参基因或所述的引物组或所述的试剂盒或所述的通用内参基因的筛选方法在杨属不同树种分子辅助育种中的应用。

14、本发明公开了以下技术效果：

15、本发明公开了一种适用于杨属不同树种茎通用内参基因的筛选方法，该方法利用来源于不同种杨树在各种不同条件(不同的茎发育时期、不同的茎组织、不同的胁迫处理)下的10组实验共298个转录组数据，大规模分析转录组的基因表达情况，筛选在不同条件下表达最稳定的基因作为内参基因。该筛选方法能够获得现有报道以外的新内参基因，为不同杨树在各种不同条件下的茎部基因表达分析提供了更稳定、更理想的内参基因，并利用qrt-pcr对内参基因的表达水平进行验证，证实了新的内参基因的表达稳定性。该方法也同样适用于其它属植物通用内参基因的筛选，为同一属内不同物种间的通用内参基因的筛选和鉴定提供重要参考。

16、同时，本发明为杨树筛选出3个适用于不同条件下茎的新内参基因，对于开展杨树分子生物学研究和生物技术育种具有重要的指导作用。