检测OPN1LW基因突变的引物组合、试剂盒及方法与流程

本技术涉及分子生物学，特别是涉及一种检测opn1lw基因突变的引物组合、试剂盒及方法。

背景技术：

1、人类的正常色觉是三色的，基于3类锥体，它们对大约420nm处的光最敏感(蓝色锥体；613522)，530nm(绿色锥体；300821)和560nm(红色锥体；300822).通过比较3类锥体光感受器对光吸收的神经回路，可以分别或以各种组合感知红、黄、绿和蓝的颜色。二色性色觉是一种严重缺陷的色觉，它只使用两种光感受器：蓝加绿(protanopia)或蓝加红(deuteranopia)；见303800)。异常三色性是一种基于蓝、绿和异常类红感光细胞(protanomality)或蓝、红和异常类绿感光细胞(deuteranomality)的三色视觉。色觉缺陷通常是轻微的，但在某些情况下可能是严重的。红-绿色觉的共同变异存在于正常人和色觉缺陷者之间(deeb，2005年综述)。

2、opn1lw基因长达3.1gb，根据omim记载，opn1lw基因突变可导致红色盲/红色弱(colorblindness,protan，mim:303900)和蓝锥细胞单色视(blue cone monochromacy，mim:303700)。opn1lw基因突变导致的红色盲呈x连锁遗传，主要表现为红色色觉缺陷，不能辨别红色，对红色与深绿色、蓝色与紫红色以及紫色不能分辨，常把绿色视为黄色，紫色看成蓝色，将绿色和蓝色相混为白色。opn1lw基因突变导致的蓝锥细胞单色视(bcm)呈常染色体隐性遗传，其特征在于视网膜中不存在功能性长波长敏感锥和中波长敏感锥，主要表现为出生时严重的颜色辨别力损害，视力下降，摆动性眼球震颤和畏光等。

3、opn1lw基因突变导致的红色盲/红色弱和蓝锥细胞单色视尚无有效的治疗方法，对女性携带者进行产期诊断或胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetictesting，pgt)，是预防红色盲/红色弱和蓝锥细胞单色视出生缺陷的有效手段。pgt是指当胚胎在体外发育至卵裂期或囊胚期时，活检若干细胞进行遗传学检测，最终选择无患病风险的胚胎植入母体子宫，从而达到生育健康后代的目的。pgt可有效避免因妊娠遗传病胎儿而终止妊娠所带来的身心伤害，越来越成为有生育遗传病高风险胎儿夫妇的首选。

4、根据欧洲人类生殖与胚胎协会(eshre)“对于以扩增为基础的pgt-m实践指南”(2020年版)，建议单基因遗传病的植入前遗传学诊断，采用突变检测联合单体型分析的策略，以保证胚胎检测结果的准确度。在胚胎水平进行opn1lw基因检测的常见方法有连锁分析和突变检测。

5、多重巢式pcr法需要预先为opn1lw女性携带者筛选出杂合的短串联重复序列(str)，然后在淋巴细胞水平建立包含突变位点和杂合str位点的多重pcr体系，并在细胞水平评估各位点扩增效率及等位基因脱扣率，合格后才能应用于胚胎检测。由于str数量有限，且人群中杂合频率不同，所以多重巢式pcr法设计较为个性化，通用性较低。个性化强也意味着工作量大，周期长。

6、相较于str位点，单核苷酸多态位点(snp)数量多分布广，在人群中的发生频率超过1％，其总数达300万个，平均1个/3kb，在高通量测序平台易实现自动化分析。karyomapping技术即通过snp连锁分析间接排除基因缺陷。该芯片上有30万个snp探针用于全基因组的连锁分析，是一种综合的通用的单基因病pgd技术。但是karyomapping不能检测基因突变，所以必须要有先证者样本或合适的家系成员样本。如果没有足够的家系样本，则需要额外增加突变检测。

7、目前，临床上急需开发一种既能检测到opn1lw基因所有编码区，又能涵盖基因内及上下游足够多snp位点的方法，用于判断胚胎基因型。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供通用性强、诊断率高、成本低的检测opn1lw基因突变的引物组合、试剂盒及方法。

2、本技术的第一个方面，提供了一种检测opn1lw基因突变的引物组合，所述引物组合包括如seq id no.1～seq id no.338所示的引物对1至引物对169中的一对或者多对。

3、在其中一个实施例中，所述引物组合包括核苷酸序列如seq id no.1～seq idno.338所示的引物对1至引物对169。

4、本技术的第二个方面，提供了一种检测opn1lw基因突变的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组合。

5、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括pcr反应试剂。

6、在其中一个实施例中，所述pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dna聚合酶、mg2+和dntps中的一种或多种。

7、本技术的第三个方面，提供了一种opn1lw基因突变的检测方法，包括以下步骤：

8、获取样本的基因dna；

9、使用所述引物组合或者所述试剂盒对所述样本的基因组dna的opn1lw基因编码区及其上下游snp位点进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行分析，根据分析结果确定opn1lw基因突变类型。

10、在其中一个实施例中，所述opn1lw基因编码区及其上下游snp位点包括：chrx:151413104、chrx:151413969、chrx:151415187、chrx:151603258、chrx:151605166、chrx:151622915、chrx:151631409、chrx:151654070、chrx:151666727、chrx:151673048、chrx:151721598、chrx:151769166、chrx:151819323、chrx:151821277、chrx:151824105、chrx:151825889、chrx:151827568、chrx:151835761、chrx:151835830、chrx:151964644、chrx:151976018、chrx:151981538、chrx:152039335、chrx:152026871、chrx:152054064、chrx:152054731、chrx:152089039、chrx:152091689、chrx:152104492、chrx:152108302、chrx:152171365、chrx:152174732、chrx:152190614、chrx:152201983、chrx:152215504、chrx:152513202、chrx:152560848、chrx:152563618、chrx:152567638、chrx:152568385、chrx:152568523、chrx:152644566、chrx:152651757、chrx:152652164、chrx:152658938、chrx:152670352、chrx:152682605、chrx:152699128、chrx:152699597、chrx:152699719、chrx:152702483、chrx:152704204、chrx:152720579、chrx:152727361、chrx:152728155、chrx:152729282、chrx:152730076、chrx:152737226、chrx:152769502、chrx:152770230、chrx:152771509、chrx:152774221、chrx:152779715、chrx:152782172、chrx:152794075、chrx:152814373、chrx:152876697、chrx:152877997、chrx:152892987、chrx:152899922、chrx:152906292、chrx:153015953、chrx:153020247、chrx:153027282、chrx:153027633、chrx:153031839、chrx:153045438、chrx:153061775、chrx:153067110、chrx:153072107、chrx:153080522、chrx:153090060、chrx:153092936、chrx:153101092、chrx:153108906、chrx:153129038、chrx:153131957、chrx:153137108、chrx:153139884、chrx:153146400、chrx:153154887、chrx:153158356、chrx:153167690、chrx:153170355、chrx:153170995、chrx:153171993、chrx:153189819、chrx:153195921、chrx:153197130、chrx:153207545、chrx:153227426、chrx:153239720、chrx:153247722、chrx:153247745、chrx:153247954、chrx:153248248、chrx:153297392、chrx:153301467、chrx:153311980、chrx:153317154、chrx:153325446、chrx:153330920、chrx:153348431、chrx:153549993、chrx:153551383、chrx:153554404、chrx:153554883、chrx:153579448、chrx:153595418、chrx:153598084、chrx:153598413、chrx:153609963、chrx:153639255、chrx:153713787、chrx:153715316、chrx:153755989、chrx:153762678、chrx:153886394、chrx:153892867、chrx:153904397、chrx:153939663、chrx:153945602、chrx:153947981、chrx:154019083、chrx:154031010、chrx:154059677、chrx:154078042、chrx:154087368、chrx:154158285、chrx:154173530、chrx:154182952、chrx:154187232、chrx:154193211、chrx:154194989、chrx:154229403、chrx:154247392、chrx:154282391、chrx:154314030、chrx:154402806、chrx:154408041、chrx:154416937、chrx:154437617、chrx:154440161、chrx:154467457、chrx:154479421、chrx:154484937、chrx:154498348、chrx:154514919、chrx:154683663、chrx:154735698、chrx:154758477、chrx:154774663、chrx:154774707、chrx:154776644、chrx:154777564、chrx:154827280、chrx:154892230、chrx:154899846和chrx:155148889。

11、在其中一个实施例中，在对所述pcr扩增产物进行分析的方法包括：对所述pcr扩增产物进行高通量测序。

12、在其中一个实施例中，所述样本选自外周血、精液、口腔粘膜细胞和胚胎细胞中的一种或多种。

13、本技术的第四个方面，提供了一种所述的引物组合或所述试剂盒在用于制备检测opn1lw基因突变的产品中的用途。

14、与传统的技术相比，本技术还包括如下有益效果：

15、本技术提供了一种opn1lw基因突变的引物组合、试剂盒及方法，通过对样本的opn1lw基因编码区及其上下游snp位点进行pcr扩增的方法，可检测出样本的opn1lw的单体型和基因型。本技术的优越性主要包括以下几点：

16、(1)snp数量多：采用本技术的检测方法可对169个snp位点进行分析。

17、(2)通用性高，准确率高：采用本技术的检测方法对opn1lw携带者样本进行检测时，突变位点覆盖opn1lw致病基因6个外显子，通过标准设定为突变位点两侧各有不小于3个有效snp，受检者通过率为100％。

18、(3)成本低：采用本技术的检测引物组合物进行检测时，降低了对opn1lw的单体型分析的成本。

19、(4)效率高：省去了细胞水平预实验。