PbPCZ锌指蛋白及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程，具体涉及一种短密青霉pbpcz锌指蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

1、霉酚酸(mycophenolic acid，mpa)又名麦考酚酸，化学名是e-4-甲基-6-(1，3-二氢-7-甲基-羟基-6-甲氧基-3-氧代-5一异苯并呋喃基)-4-己烯酸；霉酚酸对次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶具有可逆性抑制作用，并对淋巴细胞活性起到选择性抑制作用。它的2-吗琳代乙酯类衍生物—霉酚酸酯(morpholinoethyl ester of mycophenolic acid，mmf)是新一代免疫抑制剂。1995年5月霉酚酸酯获得美国食品药品管理局(fda)认可，在临床治疗中用于肾移植患者预防急性排异反应，并取得了较好效果。霉酚酸是一种目前广泛应用的免疫抑制剂。除此以外，霉酚酸具有抗病毒、抗真菌、抗细菌、抗肿瘤和治疗牛皮癣的活性，在医药方面具有十分广泛的作用。

2、目前国内尚未形成具有一定规模的工业化生产，而且关于霉酚酸酯和霉酚酸发酵生产相关国内文献也较少。国际上，霉酚酸酯的生产方法有两个途径，主要是全化学合成和生物合成。化学合成法由于有一定缺点，主要是步骤多、得率低而难以工业化。生物合成法主要是采用青霉属微生物发酵生产霉酚酸，然后通过酯化反应得到霉酚酸酯。

3、目前市面上对于霉酚酸的生产主要集中在生物发酵法生产霉酚酸。霉酚酸是由青霉属(penicillium sp.)菌种产生的抗生素，具体有penicillium brevicompactum、penicillium paxilli、penicillium olivicolor、penicillium rugulosum、penicilliumcanescens、penicillium roqueforti和penicillium viridicatum等，经过发酵实验验证p.brevicompactum和p.rugulosum是其中产量最高的两种青霉种，产量范围在100-630mg/l。因此，丝状真菌短密青霉(penicillium brevicompactum)是生产霉酚酸的重要工业菌株。

4、另一种常用的提高霉酚酸生产的方法，是根据菌株自身遗传特性可以分为自然选育、诱变育种、原生质体融合、杂交育种和基因工程改造等。诱变育种是被科研人员广泛应用的生物育种方法。菌株诱变的设备比如紫外线灯都是比较常见的设备，而且效果显著，因此在工业微生物育种中广泛使用。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服上述现有技术中的至少一个缺点，提供一种pbpcz锌指蛋白及其编码基因和应用，可以通过基因手段操作pbpcz蛋白的编码基因进而高产麦考酚酸的短密青霉基因工程菌、构建方法及其应用，加强菌种在遗传特性上的改造。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了以下的技术方案：

3、本发明提供了一种pbpcz锌指蛋白，其主要特点是，氨基酸序列如seq id no：1所示。

4、本发明还提供了一种pbpcz锌指蛋白的编码基因，其主要特点是，核苷酸序列：

5、1)如seq id no：2所示；或

6、2)与1)的基因具有90％以上同源性的序列。

7、根据jgi数据库中找到的基因组和转录组信息，比对获得如seq no.2所示的pbpcz基因序列。根据该序列信息设计引物，以短密青霉nrrl864为模板克隆该序列，并进行测序。在365-402位氨基酸位点上有6个保守的半胱氨酸残基位点。

8、本发明还提供了重组质粒，其主要特点是，含有编码所述的pbpcz锌指蛋白的核苷酸序列和载体质粒。

9、较佳地，所述的载体质粒为以rnai质粒pcambia1303为骨架构建的质粒；或者，所述的载体质粒为以ppk2为骨架构建的质粒。

10、本发明提供了一种转基因细胞系或表达盒，其主要特点是，含有编码所述的pbpcz锌指蛋白的核苷酸序列。

11、本发明提供了一种重组菌，其主要特点是，包括宿主菌和所述的重组质粒，所述的宿主菌为短密青霉。

12、本发明提供了所述的pbpcz锌指蛋白或其编码基因作为调控因子在促进短密青霉的生长发育或生产霉酚酸中的应用。

13、本发明提供了所述的重组菌在生产霉酚酸中的应用。

14、较佳地，通过发酵培养重组菌，得到霉酚酸。

15、本发明提供了一种促进短密青霉生长或提高霉酚酸产量的方法，其主要特点是，在短密青霉中引入或过表达所述的pbpcz锌指蛋白的编码基因。

16、本发明提供的重组质粒p1303dual-rnai-δpbpcz的构建方法，载体质粒为以rnai质粒pcambia1303为骨架，具体包括以下步骤：

17、1、部分pbpcz基因、启动子pcit(如seq no.3所示)和终止子tcit(如seq no.4所示)的克隆：

18、根据jgi数据库中公布的短密青霉基因组序列信息和genebank公布的pbpcz基因序列以及柠檬酸合酶的序列信息，设计并合成引物：

19、tcit-f：tttcgaccgaattgagctctctcttcctggttgttttgtagtatacgcag

20、tcit-r：ctgctagcaacgtttgcgcctaatgtcccaaccgtttc

21、pcit-f：acatcaccatggttcgccaaaaaataataatagatggggagatgg

22、pcit-r：agctggtcaccagatgtacagcctagagcgttcttc

23、pbpcz400-f：cttgagcagacatcaacgagtagctcggtggtcc

24、pbpcz400-r：ttattttttggcgaacgtgagatggttggcagcc

25、pcr的反应体系是：ddh2o 18μl、短密青霉基因组模板1μl、上下游引物各2μl、buffer 25μl、dntps 1μl和高保真酶1μl。pcr反应条件：95℃预变性3min；进行35个循环：95℃变性20s，60℃退火20s，72℃按照1kb/30s速率设置延伸时间。最后72℃保温10min，反应结束后4℃保存。反应终止后，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

26、2、以pcambia1303为基本骨架进行改造，获得载体p1303dual-rnai；具体地，kpnⅰ酶切pcambia1303加入tcit片段，ncoⅰ/bsteⅱ双酶切切割载体，后加入pcit，得到反向双启动子载体p1303dual-rnai；

27、3、反向双启动子载体p1303dual-rnai与部分pbpcz基因序列连接，获得重组质粒p1303dual-rnai-δpbpcz。

28、该重组质粒p1303dual-rnai-δpbpcz可以通过根瘤农杆菌介导的方法转入短密青霉中。

29、本发明还提供了一种重组质粒ppk2-pxt-pbpcz的构建方法，载体质粒为ppk2，能够重组目的基因pbpcz，在短密青霉中实现pbpcz基因的过表达，具体包括以下步骤：根据ppk2进行改造，删掉xbaⅰ酶切位点，通过融合pcr编码，在同一位置加上pgpd-xbaⅰ-ttrpc(pxt)的强启动子的基因过表达盒，构建质粒ppk2-pxt，质粒ppk2-pxt经过xbaⅰ酶切最终形成重组质粒ppk2-pxt-pbpcz，并形成所述的pbpcz基因的表达盒pgpd-pbpcz-ttrpc。

30、该重组质粒ppk2-pxt-pbpcz通过根瘤农杆菌介导进入短密青霉，对分生孢子和次级代谢产物mpa产生显著的影响。