S-核糖同型半胱氨酸酶LuxS突变体、工程菌及制备方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及s-核糖同型半胱氨酸酶luxs突变体、工程菌及制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来的研究发现，细菌之间存在信号交流系统，即群体感应系统，对细菌形态变化及功能表达起着至关重要的作用。细菌通过群体感应系统检测周围环境中特定信号分子的浓度时刻监控着同类或异类细菌的数量和浓度变化，群体感应系统一旦检测到周围细菌的数量或者浓度达到特定值，便会通过所分泌的信号分子发出相应的信号，诱导细菌中特定基因的表达，协调改变细菌之间的行为方式，刺激菌内营养物质和代谢产物的信号传递。

2、细菌群体感应系统一般由信号分子，信号识别系统以及信号识别系统诱导的不同基因组成。革兰氏阳性菌群体感应系统的信号分子一般是自诱导肽类物质aips，其调控过程主要包括aips的合成、加工、分泌以及细菌对aips的信号响应等。革兰氏阳性菌群体感应系统由自身诱导(antoinduction，ai)和双组分信号系统(two component system，tcs)组成。自身诱导用于感知细胞间信息，而双组分信号系统用于接受信号分子。

3、在乳酸菌中，luxp-luxq-luxs-hpk-rr是群体系统中主要的信号途径，调控乳酸菌对环境的适应(耐酸、耐胆盐、抑制致病菌)、生物膜的形成等。ai与受体蛋白(luxp)结合，然后与传感器激酶(luxq)相互作用，该复合物引发磷酸化反应，诱导luxs的转录，luxs将其催化合成为信号交流分子呋喃酮酰硼酸二酯(ai-2)，然后激活组氨酸蛋白激酶(histidineprotein kinase，hpk)-应答调节蛋白(response regulator protein，rr)双组分信号转导系统，从而调控整个菌体的行为。

4、乳酸菌在自然发酵过程中受到多种环境胁迫的影响。群体感应系统能够介导细菌生物膜的形成从而提高其环境耐受性，这可能是提高乳酸菌发酵性能的潜在调控靶点。luxs的存在对于激活乳酸菌群体感应系统至关重要，但该酶及其突变体是否会影响乳酸的代谢合成以及抵抗外来环境的胁迫未为可知。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提出了一种s-核糖同型半胱氨酸酶luxs突变体、工程菌及制备方法和应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、本发明的第一方面，涉及一种s-核糖同型半胱氨酸酶突变体，其氨基酸序列为：

4、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6或seq id no.8。

5、本发明的第二方面，涉及一种菌株，具有用于编码上述的突变体的核苷酸序列。

6、本发明的第三方面，涉及一种菌株的制备方法，包括以下步骤：

7、同源重组敲除lactococcus lactis subsp.cremoris nz9000中luxs基因，获得△luxs菌株；

8、pcr扩增编码来自lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus atcc 11842的s-核糖同型半胱氨酸酶突变体基因；pcr的产物通过表达载体转入△luxs菌株，获得nz9000/pmg36e-luxs工程菌株；

9、以重组质粒pmg36e-luxs为模板，通过pcr扩增出产物，经转化处理得到的重组质粒pmg36e-luxs'再转入△luxs菌株，得到具有seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5或seq id no.7的基因序列的突变株。

10、本发明的第四方面，涉及一系列应用，包括：

11、上述的菌株在制备乳酸中的应用；

12、上述的突变体在制备乳酸中的应用；

13、上述的核苷酸序列在制备菌株中的应用。

14、本发明的有益效果：

15、本发明提供的突变体，蛋白表达水平有明显的降低，而耐酸性和l-乳酸生物合成能力却有所提高。本发明通过比较野生型和突变型菌株耐酸性和l-乳酸合成能力，结果发现本发明实施例中所构建的四种突变体酶菌株的乳酸合成能力分别为野生型的1.97，1.38，1.80和1.34倍，在ph 6.0环境下生物量分别为野生型的1.70，1.63，1.66，1.55倍。

技术特征：

1.一种s-核糖同型半胱氨酸酶突变体，其氨基酸序列为：

2.一种菌株，具有用于编码权利要求1所述的突变体的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的菌株，其特征在于，所述菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种。

4.一种菌株的制备方法，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的菌株的制备方法，其特征在于，所述的获得△luxs菌株的方法包括以下步骤：

6.根据权利要求4所述的菌株的制备方法，其特征在于，获得所述nz9000/pmg36e-luxs工程菌株的方法包括以下步骤

7.根据权利要求5所述的菌株的制备方法，其特征在于，获得所述突变株的方法包括以下步骤：

8.一种应用，包括以下应用中的任意一种：

技术总结
本发明公开了S‑核糖同型半胱氨酸酶LuxS突变体、工程菌及制备方法和应用，属于分子生物学领域。本发明将SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5或者SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列以pMG36e或能表达该酶的质粒为表达载体，以Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因LuxSA61D、LuxSS75A、LuxSG95V或LuxSD115A的高效表达。与现有技术相比，本发明所构建的四种突变菌株，具有更优异的耐酸性和L‑乳酸的生物合成能力。

技术研发人员：周悦,刘喆,李伟
受保护的技术使用者：普立思生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16