一株青霉菌F8816及其应用的制作方法

本发明涉及微生物筛选及稀有人参皂苷转化，更具体的说是涉及一株青霉菌f8816及其应用。

背景技术：

1、人参皂苷是参属名贵药用植物的主要活性成分，在医药、保健品、营养品和化妆品开发领域有着广泛的应用前景，特别是稀有人参皂苷具有显著的抗肿瘤、保护神经系统、保肝护肝等药理活性。而稀有人参皂苷是指在人参中含量极低或者不存在的皂苷，但其药理活性优于上述高含量人参皂苷。例如，稀有人参皂苷compound k具有很好的抗细胞突变、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性、抗过敏和抗炎活性。

2、稀有人参皂苷compound k属二醇组人参皂苷，尽管大量的实验已经表明稀有人参皂苷compound k具有很高的药用价值，但由于它们在自然界中含量极其稀少，很难通过传统的方法从人参等植物中分离得到，这对稀有人参皂苷的生产造成很大限制。目前，制备稀有人参皂苷的方法主要是直接酸水解法和微生物/酶转化法。直接酸水解法通常选择性较差、产率低、同时容易造成环境污染。微生物/酶转化法则具备区域选择性、立体选择性和基团选择性高、靶向性好、得率高、副产物少、无污染和容易工业化生产等优点，能完成一些用化学方法难以进行的反应，获得化学法难以得到的稀有人参皂苷compound k，被认为是生产稀有人参皂苷最具有潜力的方法。

3、现有关于人参皂苷compound k生物法制备的专利主要集中在对人参皂苷rb1的转化，例如，cn 115449536 b中提出利用黑曲霉发酵液转化人参皂苷rb1为compound k的方法；cn109536561a中介绍了一种人参内生菌催化人参皂苷rb1制备稀有人参皂苷compoundk，人参皂苷rb1底物浓度为0.25mg/ml，继续振荡培养5～10天，得到稀有人参皂苷compoundk；cn105296587a介绍了一种来自bifidobacterium breve atcc 15700双歧杆菌的β-葡萄糖苷酶，人参皂苷rb1浓度10g/l，ck转化率62～68％，但中间涉及到β-葡萄糖苷酶的纯化步骤，较为繁琐。尽管也有专利报道微生物将二醇组人参皂苷转化为稀有人参皂苷compoundk，例如，cn107746871b报道了一种裂褶菌生物转化人参皂苷制备人参稀有皂苷f2、compound k、compound o、compound y、compound mc1、compoundmc、c-mx1和c-mx的方法；然而，关于青霉菌转化二醇组大量人参皂苷转化稀有人参皂苷compoundk，目前仍然未有文献报道。

4、青霉菌广泛存在于自然界，环境适应性极强，因此，从青霉菌中获得的生物酶理论上也应该具有极强的环境适应性。人参皂苷在转化过程中因为溶解性的问题，在转化中引入有机溶剂能够提高转化效率，但是有机溶剂对酶是具有抑制作用的，因此，寻找能发酵生产高效、酶学特性稳定、特异性降解人参皂苷提取物生产人参皂苷compound k的糖苷水解酶的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种青霉菌f8816及其应用，该菌株能够将人参皂苷提取物转化为稀有人参皂苷compoundk，酶学特性稳定。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一株青霉菌f8816，所述青霉菌(penicillium murcianum)f8816于2023年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40638，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为penicillium murcianum。

4、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的青霉菌f8816在发酵产β-糖苷酶中的应用。

5、优选地，β-糖苷酶能够耐受0～10％的有机溶剂。

6、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的青霉菌f8816在对人参皂苷rb1、rb2，rc，rd转化为稀有人参皂苷compound k中的应用。

7、优选地，人参皂苷rb1，rb2，rc，rd转化为稀有人参皂苷compound k的转化途径分别为：rb1→rd→f2→compound k；rb2→cy→compound k；rc→c-mc→compound k；rd→compound k。

8、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种生产稀有人参皂苷compound k的方法，具体过程包括：

9、1)将青霉菌f8816菌株进行发酵，得到发酵液；

10、2)对步骤1)所得发酵液离心，去菌体，盐析获得粗蛋白、纯化、获得酶；

11、3)用ph 5.0的磷酸缓冲盐分别溶解酶样品和人参皂苷提取物，配制成200mg/l的酶溶液和1g/l的人参皂苷提取物溶液，然后将酶溶液与人参皂苷提取物溶液等体积混匀，置于温度为55℃的水浴锅中反应6h，反应结束后，用2倍体积的正丁醇对反应液进行萃取，将上层的正丁醇相移出到新的培养皿，然后将培养皿放置到通风橱进行挥干至恒重，得稀有人参皂苷compound k。

12、优选地，步骤1)中，将青霉菌f8816菌株进行培养发酵的过程为：

13、将青霉菌f8816菌株接种在pda培养基中，28℃培养5d，然后将菌块接种到液体培养液中，液体培养液的成分为：20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、0.5g/l nano3、1g/l kh2po4、2g/l na2hpo4、0.2g/l feso4、0.1g/l znso4、0.2g/lcuso4、1g/l cacl2、0.5g/l mgso4·7h2o，初始ph6.5，在培养温度28℃，转速180rpm的条件下培养96h。

14、优选地，步骤2)中，所述离心为8000rpm/mim；所述盐析为70％的硫酸铵进行盐析，4℃过夜，离心获得粗蛋白；所述纯化为将粗蛋白溶于水，透析袋进行脱盐。

15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株青霉菌f8816菌株，该菌株能够将人参皂苷提取物转化至已商品化且附加值高的稀有人参皂苷compoundk，酶学特性稳定，目标产物明确，转化的特异性强，在大量发酵生产人参皂苷compound k的过程中存在明显的优势。

技术特征：

1.一株青霉菌f8816，其特征在于，所述青霉菌(penicillium murcianu m)f8816于2023年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.40638，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为penicilliummurcianum。

2.权利要求1所述的青霉菌f8816在发酵产β-糖苷酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，β-糖苷酶能够耐受0～10％的有机溶剂。

4.权利要求1所述的青霉菌f8816在对人参皂苷rb1、rb2，rc，rd转化为稀有人参皂苷compound k中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，人参皂苷rb1，rb2，rc，rd转化为稀有人参皂苷compound k的转化途径分别为：rb1→rd→f2→co mpound k；rb2→cy→compound k；rc→c-mc→compound k；rd→com pound k。

6.一种生产稀有人参皂苷compound k的方法，其特征在于，具体过程包括：

7.根据权利要求6所述的一种生产稀有人参皂苷compoundk的方法，其特征在于，步骤1)中，将青霉菌f8816菌株进行培养发酵的过程为：

8.根据权利要求6所述的一种生产稀有人参皂苷compoundk的方法，其特征在于，步骤2)中，所述离心为8000rpm/mim；所述盐析为70％的硫酸铵进行盐析，4℃过夜，离心获得粗蛋白；所述纯化为将粗蛋白溶于水，透析袋进行脱盐。

技术总结
本发明公开了一株青霉菌F8816，涉及微生物筛选及稀有人参皂苷转化技术领域，青霉菌(Penicillium murcianum)F8816于2023年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40638，分类命名为Penicillium murcianum，该菌株可发酵产β‑糖苷酶，得到的β‑糖苷酶能够耐受0～10％的有机溶剂，并且可以将人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd转化为稀有人参皂苷Compound K，转化特异性强，在大量发酵生产人参皂苷Compound K的过程中存在明显的优势。

技术研发人员：薛文娇,安超,马赛箭,刘瑶,张琪雯,丁浩,刘晨,张婧婧
受保护的技术使用者：陕西省微生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15