一种野生型鸭坦布苏病毒S132全长cDNA感染性克隆质粒及其构建方法和应用

本发明涉及生物，具体地，涉及一种野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒及其构建方法和应用。

背景技术：

1、鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus，dtmuv)是水禽的一种急性、高热性传染病，其能够使水禽产蛋量急剧下降，感染鸭坦布苏病毒的水禽死亡率可达30％，该病毒已经成为危害养禽业的重要传染病之一。

2、鸭坦布苏病毒具有广泛的天然宿主，包括蚊子、鸭、鸡、鹅、鸽子和麻雀等。种鸭、蛋鸭和种鹅在感染鸭坦布苏病毒之后，主要表现为采食量下降，拉绿色稀粪、产蛋量急剧下降等临床特征；感染后期神经症状明显，表现为共济失调，头颈抽搐，翅膀麻痹，步态不稳甚至瘫痪，而感染病毒耐受后的禽类产蛋性能也会发生下降，一般无法恢复到正常水平。并且鸭坦布苏病毒除了具有广泛的禽类宿主之外，还能够感染哺乳动物，感染鸭坦布苏病毒的小鼠会表现出严重的神经症状甚至死亡。

3、鸭坦布苏病毒是一种具有囊膜的单股正链rna病毒，有帽子结构，无poly(a)尾，基因组全长约11000bp，包含5’和3’非编码区以及一个长的开放性阅读框，该开放性阅读框编码三种结构蛋白(衣壳蛋白c、膜蛋白前体蛋白prm和囊膜蛋白e)和七种非结构蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)。

4、相比于其他单股正链rna病毒，构建黄病毒的全长cdna感染性克隆更为困难，其主要原因是黄病毒的全基因组较大，并且在全基因组中含有潜在的原核毒性基因，这会导致黄病毒全长cdna感染性克隆质粒极易在原核细胞中发生基因插入、缺失和突变，很难获得稳定的基因组序列。目前大部分鸭坦布苏病毒反向遗传操作系统均是基于t7启动子建立，并通过体外转录方式获取病毒rna，过程繁琐且成本昂贵。此外，许多研究者尝试利用鸭坦布苏病毒反向遗传操作系统在其基因组的不同位置插入报告基因，以开展鸭坦布苏病毒的病毒学研究和研制活载体疫苗，目前大多将报告基因插入到病毒基因组的5’非编码区和c蛋白基因之间以及ns5蛋白基因和3’非编码区之间，插入的报告基因主要为荧光素酶报告基因，需通过荧光素酶检测试剂盒检测荧光强度。但是，插入renilla luciferase(311个氨基酸)的重组病毒在bhk-21细胞上传至第2代就检测到报告基因丢失；即使插入小巧的荧光素酶基因nanoluc(117个氨基酸)的重组病毒在bhk-21细胞上也仅能稳定传至第5代。现有将荧光素酶作为报告基因插入鸭坦布苏病毒之后，报告基因在重组病毒中通常仅能稳定表达5代左右，这不利于实际应用，极大地影响了抗病毒药物的筛选、病毒作用机制的分析、病毒活载体疫苗的研发和病毒复制机理的分析。

5、因此，目前急需构建一种能在原核细胞中稳定表达的鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒以及一种能够稳定表达较大报告基因的重组鸭坦布苏病毒，以推进鸭坦布苏病毒的基础和应用研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒及其构建方法和应用。

2、本发明的第一目的是提供一种野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒。

3、本发明的第二目的是提供一种野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒的制备方法。

4、本发明的第三目的是提供一种基于上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒制备的重组病毒。

5、本发明的第四目的是提供上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒在制备稳定表达嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒中的应用。

6、本发明的第五目的是提供一种嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒的制备方法。

7、本发明的第六目的是提供上述制备方法制备得到的嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒。

8、本发明的第七目的是提供上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒、上述重组病毒和/或上述嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒在制备鸭坦布苏病毒疫苗中的应用。

9、本发明的第八目的是提供上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒、上述重组病毒和/或上述嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒在筛选抗鸭坦布苏病毒药物中的应用。

10、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

11、一种野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒，所述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示。

12、本发明还请求保护一种野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒的制备方法，包括以下步骤：

13、s1.pbr322载体的改造：以pbr322载体质粒为模板，使用seq id no：7和seq idno：8所示引物扩增获得核苷酸序列如seq id no：9所示的片段；

14、利用nhei和sali内切酶分别双酶切pbr322载体质粒以及核苷酸序列如seq idno：9所示的片段，并利用t4 dna连接酶连接，得到核苷酸序列如seq id no：10的重组载体；

15、s2.野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒的构建：

16、以pcdna3.1载体质粒为模板，用核苷酸序列如seq id no：11和seq id no：12所示引物扩增得到a1片段；以核苷酸序列如seq id no：5所示野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna作为模板，以核苷酸序列如seq id no：13和seq id no：14所示引物扩增得到a2片段；以a1和a2片段为模板，以核苷酸序列如seq id no：11和seq id no：14所示引物扩增得到a片段；

17、以野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna为模板，以核苷酸序列如seq id no：15和seq id no：16所示引物扩增得到b片段；

18、以野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna为模板，以核苷酸序列如seq id no：17和seq id no：18所示引物扩增得到c1片段；以c1片段为模板，以核苷酸序列如seq id no：18和seq id no：19所示引物扩增得到c2片段；以c2片段为模板，以核苷酸序列如seq id no：18和seq id no：20所示引物扩增得到c片段；

19、以野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna为模板，以核苷酸序列如seq id no：21和seq id no：22所示引物扩增得到d片段，以核苷酸序列如seq id no：23和seq id no：24所示引物扩增得到e片段；

20、以野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna为模板，以核苷酸序列如seq id no：25和seq id no：26所示引物扩增得到f1片段，以核苷酸序列如seq id no：27和seq id no：28所示引物扩增得到f2片段；以f1和f2片段为模板，以核苷酸序列如seq id no：25和seq idno：28所示引物扩增得到f片段；

21、以野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna为模板，以核苷酸序列如seq id no：29和seq id no：30所示引物扩增得到g片段；

22、以野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna为模板，以核苷酸序列如seq id no：31和seq id no：32所示引物扩增得到h1片段；以pcdna3.1载体质粒为模板，以核苷酸序列如seqid no：33和seq id no：34所示引物扩增得到h2片段；以h2片段为模板，以核苷酸序列如seqid no：34和seq id no：35所示引物扩增得到h3片段；以h3片段为扩增模板，以核苷酸序列如seq id no：34和seq id no：36所示引物扩增得到h4片段；以h1片段和h4片段为模板，以核苷酸序列如seq id no：31和seq id no：34所示引物扩增得到h片段；

23、使用pac i和sma i双酶切片段d和核苷酸序列如seq id no：10所示的重组载体，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-d；使用xho i和snab i双酶切片段c和重组质粒pb-s132-d，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-cd；使用pmii和stui双酶切片段e和重组质粒pb-s132-cd，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-cde；使用stu i和sbf i双酶切片段f和重组质粒pb-s132-cde，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-cdef；使用sbf i和pme i进行双酶切片段g和重组质粒pb-s132-cdef，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-cdefg；使用pme i和sma i双酶切片段h和重组质粒pb-s132-cdefg，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-cdefgh；使用xba i和xho i双酶切片段b和重组质粒pb-s132-cdefgh，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-bcdefgh；使用pac i和xba i双酶切片段a和重组质粒pb-s132-bcdefgh，并利用t4 dna连接酶连接，得到重组质粒pb-s132-abcdefgh(简称为pb-s132-a-h)，即为权利要求1所示的野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒。

24、本发明还请求保护一种上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒制备的重组病毒，所述重组病毒的核苷酸序列如seq id no：2所示。

25、本发明还请求保护上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒在制备稳定表达嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒中的应用。

26、优选地，所述稳定表达嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒的核苷酸序列如seq idno：4所示。

27、本发明还请求保护一种嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒的制备方法，具体为：将核苷酸序列如seq id no：6所示的报告基因插入野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna的5’非编码区和编码c蛋白的基因之间；所述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna的核苷酸序列如seq id no：5所示。

28、优选地，具体为：以上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒为模板，以核苷酸序列如seq id no：37和seq id no：38所示引物扩增得到cmv-5utr-c37片段，以核苷酸序列如seq id no：39和seq id no：40所示引物扩增得到c-prm40片段；以pcaggs-egfp质粒为模板，以核苷酸序列如seq id no：41和seq id no：42所示引物扩增得到egfp-t2a片段；以egfp-t2a和c-prm40片段为模板，以核苷酸序列如seq id no：40和seq id no：41所示引物扩增得到egfp-t2a-c-prm40片段；以cmv-5utr-c37和egfp-t2a-c-prm40片段为模板，以核苷酸序列如seq id no：37和seq id no：40所示引物扩增得到核苷酸序列如seqid no：3所示的cmv-5utr-c37-egfp-t2a-c-prm40片段；用pac i和xba i双酶切核苷酸序列如seq id no：3所示的cmv-5utr-c37-egfp-t2a-c-prm40片段和核苷酸序列如seq id no：1所示的野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒，并利用t4 dna连接酶连接，得到嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒。

29、本发明还请求保护上述任一所述制备方法制备得到的嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒。

30、本发明还请求保护上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒、上述重组病毒和/或上述嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒在制备鸭坦布苏病毒疫苗中的应用。

31、其中嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒在制备鸭坦布苏病毒疫苗时用于评价疫苗是否能够有效杀灭鸭坦布苏病毒，报告基因表达的荧光能够作为病毒存活的标记。

32、本发明还请求保护上述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒、上述重组病毒和/或上述嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒在筛选抗鸭坦布苏病毒药物中的应用。

33、其中嵌合报告基因的重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒在筛选抗鸭坦布苏病毒药物时用于评价药物是否能够有效杀灭鸭坦布苏病毒，报告基因表达的荧光能够作为病毒存活的标记。

34、本发明将核苷酸序列如seq id no：5所示的野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna克隆至改造后的pbr322载体中，并在s132全长cdna的5’端引入巨细胞病毒(cmv)启动子，在其3’端引入丁型肝炎核酶序列(hdvr)和牛生长激素(bgh)终止序列，在其2650位核苷酸和2651位核苷酸之间插入了核苷酸序列如seq id no：47所示的内含子序列(intron)，从而构建了一种核苷酸序列如seq id no：1所示的野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒；以核苷酸序列如seq id no：1所示的野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒为载体，在野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna的5’utr和c蛋白基因之间插入核苷酸序列如seq id no：6所示的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)，构建了嵌合增强型绿色荧光蛋白基因的重组鸭坦布苏病毒全长感染性克隆质粒；利用该重组鸭坦布苏感染性克隆质粒获得核苷酸序列如seq id no：4所示的嵌合增强型绿色荧光蛋白基因的重组鸭坦布苏病毒，在bhk-21细胞上经过传代和连续空斑筛选后，能够得到至少稳定表达10代增强型绿色荧光蛋白的重组鸭坦布苏病毒。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、(1)本发明提供了一种野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒，所述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示，该感染性克隆质粒能够在原核细胞中稳定表达，无基因插入、缺失和突变，且能够直接用于转染以拯救活病毒，无需昂贵的试剂进行体外转录来获取病毒rna，节约了成本和时间。

37、(2)本发明以核苷酸序列如seq id no：1所示的野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒为载体，在野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna的5’utr和c蛋白基因之间插入核苷酸序列如seq id no：6所示的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)，构建了嵌合增强型绿色荧光蛋白基因的重组鸭坦布苏病毒全长感染性克隆质粒，并利用其获得核苷酸序列如seq id no：4所示的重组鸭坦布苏病毒；该重组病毒在容纳较大报告基因的前提下能够至少稳定表达10代绿色荧光蛋白。相比于荧光素酶报告基因，本发明所使用的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的检测不依赖于任何检测试剂盒，可在荧光倒置显微镜下肉眼观察结果。