一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用的制作方法

本发明属于病原菌检测，涉及一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用。

背景技术：

1、结核分枝杆菌复合群是一组基因组高度同源，可引起结核病的分枝杆菌，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等。其中结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌为引起人类结核病的主要病原菌。

2、现有检测以涂片镜检和培养的方式为主，涂片镜检敏感性低，且涂阴肺结核患者占肺结核患者一半左右，并且超过10%的结核疾病传播与涂阴肺结核有关；结核分枝杆菌培养时间长，很容易导致误诊、漏诊、潜在传播的风险。所以急需一种快速准确的诊断方法（分子生物学检测）进行诊断。但目前注册分子产品所用样本类型均为痰液、肺泡灌洗液等，而对于急重症患者、婴儿、儿童病例、无呼吸道病变的肺外结核病例等，难以获取足够的呼吸道标本进行检测，因此结核病游离dna检测应运而生。游离dna（cfdna）作为新的生物标志物已经用于临床孕妇产前诊断、肿瘤检测、器官移植术后排斥和感染检测等领域，但血液中游离dna含量一般较低，片段较小。因此高灵敏度数字pcr检测平台显示出了其检测优势。

3、例如cn112725486a公开了一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒及制备方法，此方法采用特异性基因位点is1081和数字pcr相结合的方法对标准基因和样品基因能够大量的扩增，但此方法检测靶点单一，仅能针对基因位点is1081进行检测，准确度较多基因靶点联合检测效果低。

4、cn109811036a公开了一种多交叉扩增结合生物传感检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法将体外核酸恒温扩增技术和纳米生物传感检测技术相结合，实现了对结核分枝杆菌复合群的特异基因is1081和is6110的检测，但是此方法仅能针对基因位点is1081和is6110进行检测，未能实现多基因联合检测，检测成本较高，操作复杂。

5、综上所述，亟需开发一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，进行多靶点联合检测，实现高精度、可重复、周期短和高灵敏度的检测结核分枝杆菌复合群。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针及其应用，能够联合检测is6110、is1081、gyrb和rpob 4个基因检测位点，敏感性优于单基因is6110检测，灵敏度和准确率高，特别适用于急重症、儿童、婴儿等取样困难患者，也可以用于涂片阴性、阳性或未能明确诊断患者的辅助检测，易操作。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，所述引物的核酸序列包括seq id no.1-seq id no.8所示的序列，所述荧光探针的核酸序列包括seq id no.9-seq id no.12所示的序列。

4、本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，能够联合检测is6110、is1081、gyrb和rpob 4个基因检测位点，敏感性提升到单靶点检测的1.5倍，灵敏度和准确率高，易操作。

5、seq id no.1：ggcgtactcgacctgaaaga。

6、seq id no.2：ctgaaccggatcgatgtgta。

7、seq id no.3：taccgcgaacgcagcgat。

8、seq id no.4：gccagtccgggaaatagctg。

9、seq id no.5：gacgtggtgatgacacaactacat。

10、seq id no.6：cttcgagccgggtggatag。

11、seq id no.7：cttctccgggtcgatgtcg。

12、seq id no.8：tccttgtctttgcactcgtcg。

13、seq id no.9：ccaccatacggataggggat。

14、seq id no.10：cacccgtgccgcaaccatc。

15、seq id no.11：cgactcggacgcgtatgcgatatct。

16、seq id no.12：tcgttctctgaccctcgtttc。

17、优选地，所述荧光探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。

18、优选地，所述荧光基团包括hex、vic、cy5或rox中任意一种或至少两种的组合。

19、优选地，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2或mgb中任意一种或至少两种的组合。

20、第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在制备用于检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。

21、第三方面，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针。

22、第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针在检测结核分枝杆菌复合群中的应用。

23、第五方面，本发明提供了一种检测结核分枝杆菌复合群的方法，所述方法包括：

24、从待测样本中提取cfdna作为模板，利用第一方面所述的用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针进行多重液滴数字pcr扩增，根据pcr扩增结果进行判断。

25、游离dna（cfdna）可以替代组织或作为组织检测的补充，解决了传统的检测结核分枝杆菌复合群常用的标本为病理组织或细胞学标本，但是组织取材具有创伤性的缺陷，不受受到肿瘤大小和部位的影响，便于取样。

26、cfdna检测结核分枝杆菌复合群仍存在一些挑战：（1）血浆cfdna含量因人而异，并且大多数人含量较低；（2）cfdna片段较短，最大约为180 bp；（3）cfdna中来自于肿瘤细胞的cfdna含量大多处于1%以下，甚至只能占总cfdna的万分之一所以对检测技术的灵敏度、特异性要求比较高。本发明采用数字pcr检测方法，设计了特异性引物探针，控制最大上样量，实现了cfdna样本用量低至10 ng/孔，解决了临床cfdna样本量少的难题，同时能够精确定量。

27、优选地，所述多重液滴数字pcr扩增的方法包括：

28、（1）反应体系配置、分装至8联排中；

29、（2）模板投入；

30、（3）震荡混匀、上机检测；

31、（4）设置检测程序。

32、优选地，步骤（1）中所述反应体系包括pcr缓冲液、dntp和taq dna聚合酶。

33、优选地，步骤（1）中所述反应体系包括pcr反应mix，所述pcr反应mix包括dna反应mix，所述mix的浓度为3×-5×。

34、上述3×-5×中的具体点值可以选择3×、4×、5×。优选地，所述pcr缓冲液为3×-5×pcr缓冲液，所述dntp的浓度为50 nm -200 nm，所述taq dna聚合酶的浓度为0.1 u -5u。

35、上述3×-5×中的具体点值可以选择3×、4×、5×。上述50 nm -200 nm中的具体点值可以选择50 nm、51 nm、52 nm、53 nm、60 nm、70 nm、80 nm、100 nm、150 nm、160 nm、170 nm、190 nm、195nm、196 nm、197 nm、198 nm、199 nm、200 nm。

36、上述0.1 u -5 u中的具体点值可以选择0.1 u、0.2 u、0.3 u、0.4 u、0.5 u、1 u、2u、3 u、4 u、4.5 u、4.6 u、4.7 u、4.8 u、4.9u、5 u。

37、优选地，步骤（2）中所述模板的上样量为20 ng -300 ng。

38、上述20-300 ng中的具体点值可以选择20 ng、21 ng、22 ng、23 ng、30 ng、40 ng、50 ng、60 ng、80 ng、90 ng、100 ng、120 ng、180 ng、200 ng、240 ng、260 ng、280 ng、290ng、295 ng、296 ng、298 ng、299 ng、300 ng。

39、优选地，所述判断的标准为：

40、（1）当3≤靶基因拷贝数≤1.5×105时，检测结果为阳性，为定量结果；

41、（2）当靶基因拷贝数为0时，检测结果为阴性；

42、所述靶基因拷贝数的计算公式为：

43、靶基因拷贝数（copy）=仪器测定结果（copy/μl）×0.8（nl，生成液滴体积）×有效液滴数/1000

44、优选地，所述引物的扩增靶点包括is6110、is1081、gyrb和rpob。

45、优选地，所述结核分枝杆菌复合群包括：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌或田鼠分枝杆菌中的任意一种或至少两种的组合。

46、优选地，所述待测样本包括血浆。

47、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

48、（1）本发明创造性地设计了用于检测结核分枝杆菌复合群的引物及荧光探针，能够4个基因联合检测（包括两个多拷贝插入序列），能够提高检测的敏感性，优于单基因（is6110）检测，血浆cfdna样本检测限可达到9.81 cfu/ml，灵敏度和准确率高，易操作，特异性强，与非结核分枝杆菌无交叉；

49、（2）样本类型为血浆cfdna，对于急重症患者、婴儿、儿童病例、无呼吸道病变的肺外结核病例等来说，样本易获得；

50、（3）在数字pcr平台上进行检测，对实验人员技术要求低，操作方便，可广泛应用于临床；

51、（4）耗时短，可在2 h内检测完成，结果判读简单，检测结束后即可看到数据及图结果，显示清晰。