基于超声场辅助苏云金芽孢杆菌发酵生产伴孢晶体蛋白的方法与应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种基于超声场辅助苏云金芽孢杆菌发酵生产伴孢晶体蛋白的方法与应用。

背景技术：

1、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis,简称bt)，属好气性蜡状芽孢杆菌，因其产生伴孢晶体如cry蛋白具有较好杀虫效果且环保又高效，而成为目前使用最广的微生物杀虫剂。研究发现，cry蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目和膜翅目等昆虫表现出防治效果。这些蛋白能够结合到昆虫肠道上的特定受体，引起细胞膜穿孔，细胞溶解，导致昆虫停食甚至死亡。另外，bt及其伴孢晶体对非目标生物(包括人类和其他脊椎动物)安全。除了直接作为农药使用以外，cry蛋白基因也被广泛地用于转基因作物的研发，提高作物的抗虫特性。但是，随着bt广泛推广与应用，昆虫抗性问题逐年增加，给这种绿色生物农药资源的可持续性发展带来了挑战。

2、目前关于研究超声场对苏云金芽孢杆菌影响的报道较少。现有技术中，超声处理步骤常用于胞外代谢产物的提取，如专利cn105664135a中，公开了球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢产物的提取方法，球形芽孢杆菌培养过夜后，震荡培养至芽孢晶体从菌株中完全释放，收集发酵液，离心取沉淀，将沉淀洗涤后重悬处理，然后在超声波处理，直至晶体、芽孢及细胞碎片充分分散，震荡混匀，除去泡沫，离心，取沉淀；其中超声处理的作用在于使晶体、芽孢及细胞碎片充分分散。并未见现有技术公开低频超声在苏云金芽孢杆菌增值阶段作用，以提高伴孢晶体蛋白的产量的技术内容。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种基于超声场辅助苏云金芽孢杆菌发酵生产伴孢晶体蛋白的方法；本发明的另一目的是提供一种苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白；本发明的另一目的是提供一种苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白在农业防虫害或食品抗菌上的应用。

2、技术方案：本发明的基于超声场辅助苏云金芽孢杆菌发酵生产伴孢结晶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

3、(1)苏云金芽孢杆菌接种到固体培养基中，培养一段时间，得到活化的苏云金芽孢杆菌；

4、(2)所述活化的苏云金芽孢杆接种到液体培养基中，培养一段时间，得到处于增殖阶段的苏云金芽孢杆菌培养液；

5、(3)对上述处于增殖阶段的苏云金芽孢杆菌培养液进行低频超声处理，以刺激苏云金芽孢杆菌培养液生产伴孢晶体蛋白，得到经超声处理的苏云金芽孢杆菌培养液；

6、其中，低频超声处理条件为：超声功率为0-440w，超声时间为0-75min、超声方式为间歇或连续式处理；优选地，超声功率为176-440w，超声时间为45-75min。

7、(4)所述经超声处理的苏云金芽孢杆菌培养液继续培养一段时间，直至苏云金芽孢杆菌停止繁殖，得到苏云金芽孢杆菌发酵液；

8、(5)提取苏云金芽孢杆菌发酵液中的伴孢结晶蛋白。

9、优选的，步骤(1)中，固体培养基为lb固体培养基；培养条件为：在30-37℃下培养24-30h。

10、优选的，步骤(2)中，所述增殖阶段为对数生长阶段或稳定阶段。

11、作为上述方案的进一步改进，步骤(2)中，培养条件为：温度为30-37℃，转速120-180rpm，培养8-18h；步骤(2)至步骤(4)的培养时间合计为24-36h。优选地，温度为35-37。

12、作为上述方案的进一步改进，步骤(5)中，所述提取苏云金芽孢杆菌发酵液中的伴孢结晶蛋白，包括苏云金芽孢杆菌发酵液进行酶解一段时间，然后反复冻融若干次，得到孢晶混合液；孢晶混合液中沉淀即为伴孢结晶蛋白。

13、作为上述方案的更进一步改进，步骤(5)中，苏云金芽孢杆菌发酵液中加入溶菌酶溶液进行酶解，溶菌酶溶液的浓度为50-500μg/l，酶解时间为10-30min。

14、作为上述方案的更进一步改进，步骤(5)中，冻融过程为：冷冻20-40min,取出后立即放入30-50℃水浴中加热10-30min。

15、作为上述方案的更进一步改进，步骤(5)中，干燥条件为：在40-60℃条件下真空干燥4-10h或冷冻干燥6-12h。

16、一种基于超声处理辅助苏云金芽孢杆菌发酵生产伴孢晶体蛋白的方法与应用，包括以下步骤：

17、步骤1，lb液体培养基制备

18、作为上述方案的进一步改进，基于超声场辅助苏云金芽孢杆菌发酵生产伴孢结晶蛋白的方法，具体包括以下步骤：

19、步骤1，按照质量比为1:2:200称取酵母提取物、胰蛋白胨和质量分数0.9％氯化钠溶液混合，搅拌至溶解，调整ph为6-8，然后进行灭菌处理，灭菌条件为：0.08-0.15mpa、115-125℃下，高压灭菌10-30min，灭菌结束后，冷却至室温，备用；

20、步骤2，苏云金芽孢杆菌活化。在无菌条件下，将苏云金芽孢杆菌接种到装有lb固体培养基的培养皿中，在30-37℃下培养24-30h，得到活化的苏云金芽孢杆菌；

21、步骤3，在无菌条件下将苏云金芽孢杆菌接种至50-200ml lb液体培养基中，在培养箱条件下：温度为30-37℃，转速120-180rpm，培养0-36h，得到处于不同发育阶段(适应期0-8h、对数生长期8-18h、稳定期18-26、衰退期26-36h)的苏云金芽孢杆菌培养液。

22、步骤4，取30-100ml处理步骤3中处于不同发育阶段(0、8、18、26h)的苏云金芽孢杆菌培养液，分别利用不同超声条件：超声频率为20-80khz，超声功率为0-440w，超声时间为0-75min、超声方式为间歇(超声5min/间歇5min)、连续式处理，得到经超声处理的苏云金芽孢杆菌培养液。

23、步骤5，将步骤4得到的苏云金芽孢杆菌培养液，继续培养至24-36h，得到最终苏云金芽孢杆菌发酵液。

24、步骤6，按照比例1:10，将50-500μg/l溶菌酶溶液加入至步骤5得到的最终苏云金芽孢杆菌发酵液中，经过酶解10-30min后，冷冻20-40min，取出后立即放入30-50℃水浴中加热10-30min，反复冻融2-5次，得到孢晶混合液。

25、步骤7，将步骤6得到的孢晶混合液进行在4℃条件下，转速为5000-10000rpm/min，离心10-30min,弃上清，得沉淀。然后加入离子水洗涤沉淀，在震荡或摇晃使其产生泡沫，弃泡沫，重复操作2-5次，最终得到无泡沫的沉淀。将沉淀物在40-60℃条件下真空干燥4-10h或冷冻干燥6-12h，得到淡黄色晶体蛋白粗提物，即为伴孢晶体。

26、另一方面，本发明提供一种由上述方法制备所得的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

27、另一方面，本发明提供一种上述的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白在农业防虫害或食品抗菌上的应用。

28、所述应用包括制备抗菌剂或杀虫剂。

29、超声会影响微生物的增殖与代谢。低频超声场场长在50-500khz，属于振动场，可进行能量传播。低频超声场可能会提高微生物发酵液混合和传质效率，增强微生物的抗逆性、刺激活性，提高对营养物质的利用率，促进微生物的生长繁殖和目标发酵产物的得率，开始在微生物发酵工业中被应用。但是，目前关于研究超声场对苏云金芽孢杆菌影响作用的相关内容较少，因此，我们探讨低频超声对bt及伴孢晶体产量及物化结构的影响。同时，对其产品伴孢晶体进行结构表征及抗虫特性分析。研究结果，不仅能为bt在害虫防治领域的实际应用提供依据，而且将为bt工程菌进一步改造及工业化应用提供线索。

30、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1.本发明与传统方法相比，制备过程中只需要添加超声场辅助苏云金芽孢杆菌发酵，因此，具有操作简单、安全、无有毒试剂残留、成本低且无有毒、有害有机试剂添加等特点；

31、2.本发明苏云金伴孢晶体蛋白，粒径小、颗粒均一、分散性好；

32、3.苏云金伴孢晶体蛋白较好的杀虫、抗菌特性，病虫害防治效果，可以作为杀虫、抗菌剂防治各种病虫害，在农业、食品领域具有潜在的应用。