低盐复合酶两步保温酶解法提取肝素钠粗品新技术的制作方法

本发明涉及低盐复合酶两步保温酶解法提取肝素钠粗品新技术，属于从猪小肠黏膜液提取肝素钠粗品的生产工艺。

背景技术：

1、肝素钠是一种酸性粘多糖，经进一步加工提纯后为药典规定的精品肝素钠。肝素钠粗品为无臭黄色，浅黄色，白色或灰白色粉末，具有吸湿性，易溶于水，不溶于有机溶剂，旋光度在+42～+56之间，波长在185～220nm处有特征吸收峰。肝素钠广泛用于防治各种心脑血管疾病，是最有效的抗凝血药物，主要用于：(a)治疗各种疾病并发的播散性血管内凝血早期；(b)预防动、静脉血栓和肺栓塞；(c)治疗动、静脉血栓和肺栓塞，缺血性脑卒中，不稳定型心绞痛(减轻症状、预防心肌梗塞)，急性心肌梗塞(防止早期再梗塞和梗塞区延展，降低病死率)；(d)作为溶血栓疗法的维持治疗；(e)用于输血时预防血液凝固及血库保存鲜血等体外抗凝剂。

2、肝素钠分子结构极其复杂，目前只能从动物组织中提取获得。目前，欧美的官方药政认可的肝素钠来源，是猪小肠黏膜液。

3、现有肝素钠粗品生产行业主要的生产技术方案，有高盐盐解法、酶解法、盐解酶解复合法等。专利cn 103755837a涉及一种利用盐解酶解复合法从猪小肠制备肝素钠的方法，所用的盐解条件为2％～2.5％的盐度，所用的酶为碱性蛋白酶2709，所述方法生产1亿个单位的肝素钠，需要1400-1600根猪小肠，因其单一酶的特定酶解切割位点，不能达到饱和有效完全地的切割掉肝素钠分子上链接的蛋白质分子，致使肝素钠大分子不能完全游离释放出来，影响了肝素钠粗品的产量。另外，现有酶解生产工艺中，盐浓度在2.5％左右，造成废水中氯离子严重超标，面临处理麻烦的环保问题。

技术实现思路

1、本发明旨在提出一种使用生物活性复合酶两步保温酶解的方法，提供多酶解切位点，有效切割链接在肝素钠大分子上的蛋白质分子，最大量地游离释放出肝素钠大分子，从而提高肝素钠粗品产量(收率)和质量。

2、本发明提供了一种从猪小肠黏膜提取肝素钠粗品，在低盐条件下的高效生产方法，包括以下七个步骤：

3、(1)刮肠并调配猪小肠黏膜液体积：将新鲜猪小肠用软化水刮肠，得到的黏膜液用软化水进行稀释，达到每根猪小肠黏膜液体积8.0l比例，与现有方法每根猪小肠黏膜液体积10.0～12.0l比例，减少20％以上；

4、(2)低盐处理猪小肠黏膜液：向步骤(1)得到的猪小肠黏膜溶液中，添加食品级肠衣盐氯化钠或者肠衣盐的浓盐水，达到终浓度≤0.7％，与现有方法每根猪小肠黏膜液体积10.0l和黏膜液盐浓度2.5％比较，盐用量减少了77.0％；

5、(3)两步保温酶解：调节步骤(2)得到的低盐猪小肠黏膜液的ph至8.5，加入复合酶，在35～45℃酶解60～150分钟；然后调节ph至7～9，在50～60℃酶解60～150分钟，得完全酶解液；所述复合酶的添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.05～0.10％；

6、(4)酶解液灭活：将步骤(3)所述酶解液于60～85℃，保温10～60分钟；

7、(5)吸附：将步骤(4)灭活后的酶解液进行过滤并调节温度至48～65℃，ph7～9，进行树脂吸附，得到肝素钠粗品溶液；所述树脂的质量占猪小肠的黏膜液质量的0.3～0.5％；

8、(6)树脂洗涤和树脂脱附：将步骤(5)得到的吸附肝素钠的树脂，用质量分数4.0～6.0％的稀盐水洗涤2遍。然后，用质量分数16～25％的浓盐水，将肝素钠从树脂上脱附，得到含肝素钠粗品的脱附液；

9、(7)收集肝素钠粗品：将步骤(6)得到的肝素钠粗品的脱附液，进行醇沉与干燥，得到干燥的肝素钠粗品固体。

10、在一种实施方式中，步骤(3)所述复合酶包括10～30％胰酶、20～60％木瓜蛋白酶、10～50％碱性2709蛋白酶和5～30％胶原蛋白酶；所述胰蛋白酶的活性≥4000u/克，所述木瓜蛋白酶的活性≥300000u/克，所述碱性2709蛋白酶的活性≥200000u/克，所述胶原蛋白酶的活性≥100000u/克。

11、在一种实施方式中，所述复合酶包括15～25％胰酶、35～45％木瓜蛋白酶、25～35％碱性2709蛋白酶和5～15％胶原蛋白酶。

12、在一种实施方式中，步骤(3)所述复合酶的添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.050～0.090％。

13、在一种实施方式中，步骤(2)中氯化钠的终浓度为0.5～0.7％。

14、在一种实施方式中，步骤(1)所述稀释是将每根猪小肠黏膜液体积稀释为7.5～8.5l。

15、在一种实施方式中，步骤(5)所述树脂的质量占猪小肠黏膜液质量的0.4～0.5％。

16、在一种实施方式中，步骤(6)所述醇沉是用终浓度25～55％的乙醇，静置12～24小时。

17、在一种实施方式中，步骤(6)所述肝素钠沉淀，用质量百分比浓度大90％的酒精进行脱水，脱水时间2～3个小时。

18、在一种实施方式中，步骤(7)所述脱水后的肝素钠沉淀，用200目过滤网，过滤。然后，使用真空干燥系统，在真空度65帕，恒温65度下，干燥12个小时，即达到干燥的肝素钠粗品固体产品。

19、本发明还提供了由所述的方法制备得到的肝素钠粗品。

20、本发明还提供了所述方法在制备含肝素钠的产品中的应用。

21、有益效果：

22、1、本发明使用猪小肠黏膜液体积比例，比较现有技术的体积比例(10-12l/根)相比，降低20％，达到减少废水排放量20％。本发明使用了≤0.7％的盐溶液，达到低盐条件。所产生的废水中，氯离子的质量百分比浓度小于0.7％，相较于现有技术的高盐浓度2.5％，氯离子浓度下降率达到70％。叠加20％肠黏膜液体积的减少，总氯离子含量下降率达到77％。大大地降低了废水排放的环保压力，降低了成本。

23、2、本发明在低盐条件下，使用复合酶酶解新技术，对蛋白质分子的多位点饱和切割，达到最大量地去除掉链接在肝素钠大分子上的蛋白质分子，从而达到释放出游离的具有抗凝血生物活性的肝素钠大分子。所得酶解液中肝素钠的效价为14.5uspu/ml，相当于收率11.6万uspu/根；所得肝素钠粗品收率为9.8万美标单位/根(即1020根/亿单位，美标uspu)。比较现有技术的粗品肝素钠收率为1320～1360根/亿，提升幅度为29.4～33.3％，极大地提高了收率。

24、本发明技术，在废水排放指标和肝素钠粗品产品收率两个方面，极大地满足工业生产的需求。

技术特征：

1.一种从猪小肠黏膜提取肝素钠粗品的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述复合酶包括10～30％胰酶、20～60％木瓜蛋白酶、10～50％碱性2709蛋白酶和5～30％胶原蛋白酶；所述胰蛋白酶的活性≥4000u/克，所述木瓜蛋白酶的活性≥300000u/克，所述碱性2709蛋白酶的活性≥

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复合酶包括15～25％胰蛋白酶、35～45％木瓜蛋白酶、25～35％碱性2709蛋白酶和5～15％胶原蛋白酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述复合酶的添加量为猪小肠黏膜溶液质量的0.050～0.090％。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中氯化钠的终浓度为0.5～0.7％。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述稀释是将每根猪小肠黏膜液体积稀释为7.5～8.5l。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述树脂的质量占猪小肠黏膜溶液质量的0.4～0.5％。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述醇沉是用终浓度25～55％的乙醇，静置12～24小时。

9.权利要求1～8任一所述的方法制备的肝素钠粗品。

10.权利要求1～8任一所述方法在制备含肝素钠的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了低盐复合酶两步保温酶解法提取肝素钠粗品新技术，属于从猪小肠黏膜液提取肝素钠粗品的生产工艺技术领域。本发明在低盐条件下，使用复合酶酶解技术，达到多位点饱和切割肝素钠大分子连接的蛋白质分子，从而有效释放出游离的具有抗凝血生物活性的肝素钠大分子，所得酶解液中肝素钠的效价为14.5USPU/ML，相当于收率11.6万USPU/根；所得固体肝素钠粗品收率为9.8万美标单位/根。与现有生产技术相比，本发明废水排放总量减少20％，废水中的总盐含量减少78％。本发明在提高肝素钠粗品产品收率，大幅度减少废水污染物含量，两个方面，达到满足工业生产的需求。

技术研发人员：董世明,王运龙,何刚,朱东升,李永琴,李光勋,董豹
受保护的技术使用者：上海天饴生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22