一种视网膜色素上皮细胞的制备方法

本发明涉及细胞生产，尤其涉及一种视网膜色素上皮细胞的制备方法。

背景技术：

1、视网膜色素上皮（rpe）是一种单层的色素细胞，位于神经性视网膜和脉络膜之间，在维持光感受器方面具有重要功能。视网膜色素上皮功能障碍被认为是年龄相关性黄斑变性（amd）发病机制的一个重要因素，抗血管内皮生长因子疗法对湿性年龄相关性黄斑变性有效；然而，占年龄相关性黄斑变性患者大多数的干性年龄相关性黄斑变性却无法从目前的疗法中获益。近年来，人们越来越关注视网膜色素上皮细胞的移植，目的是用健康的视网膜色素上皮细胞取代退化的视网膜色素上皮细胞。异体和自体的视网膜色素上皮细胞移植已被报道，但两者都不是理想的组织来源；前者会诱发免疫排斥，而后者则需要一个侵入性的程序来获取视网膜色素上皮细胞。因此，由人类诱导多能干细胞（hipscs）衍生的视网膜色素上皮细胞，能够作为自体移植或无限繁殖，是克服现有缺点的替代细胞的理想来源，开发一种高效益方法来生产高质量的干细胞来源视网膜色素上皮细胞，对于推动未来年龄相关性黄斑变性和潜在的其他人类或动物的眼病的治疗非常必要。

2、现有技术中cn113699097b公开了一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，在悬浮培养后，使用含有烟碱的培养基对所述拟胚体进行贴壁培养三周以上，并在所述贴壁培养的第2-3周于培养基中再添加激活素a进行培养，得到视网膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞前体。但是此方法中的烟碱为剧毒物质，用于生产并不安全。并且现有的由多能诱导干细胞分化为成熟的视网膜色素上皮细胞需要5-6个月时间，培养过程时间长；同时需要加在不同节点给培养基加入不同的生长因子，培养成本较高，过程较繁复。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，用于解决现有技术中诱导得到视网膜色素上皮细胞的方案复杂、效率较低等问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：

4、s1.将干细胞接种至干细胞完全培养基，培养12~36h；

5、s2.将干细胞完全培养基更换为混合培养基1号，培养12~36h；

6、s3.将混合培养基1号更换为混合培养基2号，培养12~36h；

7、s4.将混合培养基2号更换为诱导培养基①，培养15~23d；

8、s5.将诱导培养基①更换为诱导培养基②，培养35~45d，得到含黑色素的细胞；

9、s6.将含黑色素的细胞进行消化-融合培养，得到融合细胞；

10、s7.将融合细胞接种至诱导培养基②，培养得到视网膜色素上皮细胞；

11、所述s1中培养采用的o2体积浓度为3~8%；

12、所述混合培养基1号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基1号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为2.8~3.2:1；

13、所述混合培养基2号中含有干细胞完全培养基和诱导培养基①，所述混合培养基2号中干细胞完全培养基和诱导培养基①的体积比为0.8~1.2:1；

14、所述诱导培养基①以dmem/f12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为0.8~1.2%的n-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸、0.8~1.2mmol/l的丙酮酸钠、1.8~2.2μg/ml的肝素、体积百分比为8~12%的无血清替代液，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；

15、所述诱导培养基②以混合基础培养基为溶剂，含有以下终浓度的组分：体积百分比为1~3%的b27添加剂、0.8~1.2mmol/l的丙酮酸钠、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×；

16、所述混合基础培养基中含有dmem培养基和f12培养基，所述dmem培养基和f12培养基的体积比为2.8~3.2:1。

17、优选的，所述s1中培养采用的co2体积浓度为8~12%。

18、优选的，所述干细胞完全培养基为mtesr培养基。

19、优选的，所述s2~s7中培养采用的o2体积浓度为18~22%。

20、优选的，所述s2~s7中培养采用的co2体积浓度为3~8%。

21、优选的，所述s6中的消化-融合培养包括以下步骤：

22、将含黑色素的细胞消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；

23、将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状；

24、将融合成片状的细胞再次进行消化，消化后接种至融合培养基中，培养至细胞完全融合成片状，得到融合细胞。

25、优选的，所述消化采用胰蛋白酶-edta溶液作为消化剂；

26、所述胰蛋白酶-edta溶液的浓度为0.2~0.3%。

27、优选的，所述消化的时间为20~50min；

28、所述培养至细胞完全融合成片状采用的容器用层粘连蛋白包被，所述层粘连蛋白的浓度为8~12μg/ml。

29、优选的，所述融合培养基以dmem/f12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为8~12%的无血清替代液、体积百分比为0.8~1.2%的n-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸、0.8~1.2mmol/l的丙酮酸钠、8~12mmol/l的烟酰胺和8~12μmol/l的rock抑制剂，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×。

30、优选的，所述视网膜色素上皮细胞的跨细胞电阻在300ω/cm2以上。

31、本发明的技术效果和优点：

32、本发明通过设置特定的培养参数、利用特定的诱导培养基，能够成功诱导得到视网膜色素上皮细胞，本发明提供的制备方法操作简单、制备效率高，提高了干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的性能，最终得到了一种稳定、高效率、低成本的视网膜色素上皮细胞制备方法。

技术特征：

1.一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述s1中培养采用的co2体积浓度为8~12%。

3.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述干细胞完全培养基为mtesr培养基。

4.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述s2~s7中培养采用的o2体积浓度为18~22%。

5.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述s2~s7中培养采用的co2体积浓度为3~8%。

6.根据权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述s6中的消化-融合培养包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述消化采用胰蛋白酶-edta溶液作为消化剂；

8.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述消化的时间为20~50min；

9.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述融合培养基以dmem/f12培养基为基础培养基，含有以下终浓度的组分：体积百分比为8~12%的无血清替代液、体积百分比为0.8~1.2%的n-2添加剂、稀释倍数为80~120倍的非必需氨基酸、稀释倍数为80~120倍的谷氨酸、0.8~1.2mmol/l的丙酮酸钠、8~12mmol/l的烟酰胺和8~12μmol/l的rock抑制剂，所述非必需氨基酸和谷氨酸的原液倍数为100×。

10.根据权利要求6所述的视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞的跨细胞电阻在300ω/cm2以上。

技术总结
本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，属于细胞生产技术领域。本发明通过设置特定的培养参数、利用特定的诱导培养基，能够成功诱导得到视网膜色素上皮细胞，并克服了现有技术中诱导得到视网膜色素上皮细胞的方案复杂、效率较低等问题。本发明提供的制备方法提高了干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的性能，并且还发现了培养过程的早期在低氧条件下培养，并且培养中不使用抗生素更有利于制备视网膜色素上皮细胞，最终得到了一种稳定、高效率、低成本、操作简单的视网膜色素上皮细胞制备方法。

技术研发人员：刘凡菲
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15