一种ω-胺转氨酶、重组菌及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种ω-胺转氨酶、重组菌及其应用。

背景技术：

1、草铵膦(phosphinothricin，ppt；化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，能通过抑制植物谷氨酰胺合成酶来发挥除草作用。草铵膦与草甘膦以及百草枯并称世界三大除草剂，目前百草枯因为剧毒已停产，草甘膦也因为长期使用而使植物产生抗性而导致市场逐渐萎缩，而草铵膦具有灭生性广、低毒且对环境友好等特点，具有良好的市场前景。

2、草铵膦有两种光学异构体，分别为l-草铵膦和d-草铵膦。但只有l-草铵膦具有植物毒性，其除草活性为普通市售外消旋dl-草铵膦的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。如果草铵膦产品能以l型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有重要意义。

3、目前制备光学纯l-草铵膦的方法主要有三种：化学合成法、手性拆分法以及生物催化法。

4、化学合成法从手性原料出发合成光学纯l-草铵膦，该方法工艺步骤多、收率低，所用不对称合成试剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备l-草铵膦。

5、手性拆分法是通过化学合成外消旋dl-草铵膦或其衍生物，再利用手性拆分试剂，进行d型和l型异构体的分离，从而制得光学纯的l-草铵膦。此工艺存在单次拆分收率低、工艺复杂的技术问题。

6、相比之下，生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化等优点，是生产l-草铵膦的潜在优势方法。

7、在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，l-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨反应被分解成一种2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)。转氨反应是一个可逆反应，ppo可在转氨酶的催化下通过转氨反应生成l-草铵膦。但是该生成l-草铵膦的转氨反应的缺陷在于不利的平衡常数，目前研究多集中于副产物的移除和分解。丙氨酸作为典型的氨基供体，脱氨基产物为丙酮酸，不仅对酶有较强的的抑制能力，也是限制平衡的关键因素之一。目前，通常用来移除丙酮酸的酶有乳酸脱氢酶（ldh）、丙氨酸脱氢酶（aladh）、丙酮酸脱羧酶（pdc）、乙醇脱氢酶（adh）以及偶联gdh或fdh等。

技术实现思路

1、在为解决上述技术问题，本发明提供了一种ω-胺转氨酶、重组菌及其应用。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明的第一目的在于，提供一种ω-胺转氨酶，所述ω-胺转氨酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明的ω-胺转氨酶基因来源于人苍白杆菌ochrobactrum anthropic zjb-061(cn101063090a专利现有菌株，具体保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072；保藏日期为2006年4月14日；保藏编号为cctcc no:m206039)，将该菌在ncbi中进行比对后，选择了与其相近的已经全基因组测序的同源菌种ochrobactrumanthropic（genbank:cp022605.1）为参照，对其基因组中所有ω-胺转氨酶基因进行分析，从中筛选获得与其同源性最高的基因序列进行克隆引物设计，并发现克隆产物与ochrobactrumanthropi (wp_011982390.1)来源的ω-转氨酶蛋白序列的相似性仅为69.52％，验证了其ω-胺转氨酶的功能与应用价值。

5、作为优选，所述ω-胺转氨酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、作为优选，所述ω-胺转氨酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

7、由于如seq id no.2所示的ω-胺转氨酶基因可溶性表达量较低，为提高可溶性表达效率，本发明根据大肠杆菌表达系统的偏好性，对ω-胺转氨酶基因原始序列进行了密码子优化，得到了如seq id no.3所示的序列。

8、本发明的第二目的在于，提供一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包含有编码ω-胺转氨酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示。

9、作为优选，所述重组表达质粒是将编码基因插入pet-28a载体得到。

10、本发明的第三目的在于，提供一种重组基因工程菌，包含有上述任一种重组表达质粒。

11、作为优选，所述重组工程菌是将重组表达质粒转入宿主大肠杆菌bl21(de3)或大肠杆菌top10得到。

12、作为进一步优选，所述重组工程菌是将重组表达质粒转入宿主大肠杆菌bl21(de3)得到。

13、本发明的第四目的在于，提供一种生产ω-胺转氨酶的方法，所述生产方法为：将上述任一种重组基因工程菌进行发酵培养，将培养后的重组基因工程菌破壁后进行分离纯化，得到ω-胺转氨酶。

14、本发明的第五目的在于，提出上述ω-胺转氨酶、重组表达质粒或者重组基因工程菌在转氨反应中进行应用。

15、本发明中转氨反应是指催化氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体醛、酮或酮酸的反应。所述转氨反应具体可以用于动力学拆分制备或不对称合成制备非天然氨基酸、用于制备脂肪族和芳香族非天然氨基酸或者用于制备手性胺和手性氨基酸。

16、作为进一步优选，本发明还提出上述ω-胺转氨酶、重组表达质粒或者重组基因工程菌在通过转氨反应合成l-草铵膦中应用。

17、ω-胺转氨酶能高效转化丙酮酸，可以用来催化丙酮酸来辅助生成l-丙氨酸，而l-丙氨酸又是以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物转氨反应制备l-草铵膦的常用氨基供体，经反应后生成丙酮酸，因此本发明的ω-胺转氨酶可以改善以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物转氨反应制备l-草铵膦的过程中，副产物丙酮酸对该转氨反应的正向抑制作用，缓解转氨反应的不利平衡常数问题。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、本发明首次从人苍白杆菌ochrobactrum anthropic zjb-061中克隆、鉴定了一种新型ω-胺转氨酶基因，经验证发现该ω-胺转氨酶可以改善转氨反应的不利平衡常数问题，在以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物转氨作用制备l-草铵膦等类似可逆转氨反应中该酶具有转化酮酸等副产物来推动反应平衡的巨大潜力。

20、其余有益效果将在实施例中展开说明。

21、序列描述

22、seq id no.1为ω-胺转氨酶ata-oc3氨基酸序列；

23、seq id no.2为ω-胺转氨酶ata-oc核苷酸序列；

24、seq id no.3为ω-胺转氨酶ata-oc优化后的ω-胺转氨酶ata-oc3的核苷酸序列；

25、seq id no.4为ochrobactrum anthropic zjb-061中克隆基因正向引物ata-ocf；

26、seq id no.5为ochrobactrum anthropic zjb-061中克隆基因反向引物ata-ocr。