一种麻疹病毒攻毒动物模型及其建立方法与流程

本发明涉及一种麻疹病毒攻毒动物模型及其建立方法，属于生物。

背景技术：

1、麻疹是由麻疹病毒（measles virus）感染引起的急性呼吸道传染病，是一种自限性疾病，具有高度传染性，极易在人群之间传播，可导致严重并发症，临床上以发热、上呼吸道炎症、眼结膜炎及皮肤出现红色斑丘疹和颊黏膜上有麻疹黏膜斑，疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑为特征，常并发呼吸道疾病如中耳炎、喉-气管炎、肺炎等，麻疹脑炎、亚急性硬化性全脑炎等严重并发症。目前，尚无特效药物治疗。接种麻疹疫苗可有效预防麻疹病毒感染，自普种麻疹减毒活疫苗后，麻疹发病显著下降。

2、麻疹病毒是一种噬神经病毒，出于对麻疹减毒活疫苗安全性的考虑，当从具有中枢神经系统靶向性的野毒株中分离得到麻疹病毒减毒疫苗株时，需要使用动物进行毒力研究，以评价麻疹减毒疫苗株的安全性。人类是麻疹病毒的唯一天然宿主，但麻疹病毒也可以传染给包括食蟹猴、恒河猴、日本猕猴、狨猴等在内的多种非人灵长类动物，且会导致高发病率和死亡率，因此，现阶段，通常使用实验用猴对麻疹病毒减毒疫苗株进行毒力评价。尤其是实验用猴处于应激状态或免疫力低下时，更容易感染麻疹病毒和由此引发的继发感染。然而，实验用猴长期存在资源紧张的问题。

3、也有研究尝试使用易获得的实验用鼠对麻疹病毒减毒疫苗株进行毒力评价。当前，基于实验用鼠开发的可用于麻疹病毒毒力评价的动物模型主要有cd46转基因小鼠、slam转基因小鼠和ifnα/βr-/-基因（ifnar）缺失小鼠这三种。其中，cd46转基因小鼠通过将人源cd46基因在小鼠中表达构建而得，slam转基因小鼠通过将人源slam基因在小鼠中表达构建而得，ifnα/βr-/-基因缺失小鼠通过敲除小鼠i型干扰素受体基因构建而得。

4、然而，cd46转基因小鼠、slam转基因小鼠和ifnα/βr-/-基因缺失小鼠这三种动物模型在用于麻疹病毒毒力评价时仍存在缺陷。例如，cd46转基因小鼠由于缺乏slam受体（麻疹病毒的受体主要有slam、cd46和nectin-4，其中，slam是所有麻疹病毒都存在的受体，而cd46主要存在于实验室适应株），只能适用于麻疹病毒实验室适应株的毒力评估，无法区分麻疹病毒野毒株和麻疹病毒减毒疫苗株；slam转基因小鼠虽然存在slam受体，但是，slam转基因小鼠对麻疹病毒的敏感性受日龄影响，日龄越大，slam转基因小鼠对麻疹病毒的敏感性越低，一般仅有日龄小于28天的slam转基因小鼠可用于麻疹病毒的毒力评价，这严重限制了slam转基因小鼠在麻疹病毒毒力评价中的应用（参见文献“sellin, c. i.; davoust,n.; guillaume, v.; baas, d.; belin, m.-f.; buckland, r.; wild, t. f.; horvat,b. (2006). high pathogenicity of wild-type measles virus infection in cd150(slam) transgenic mice. journal of virology, 80(13), 6420-6429.”）；ifnα/βr-/-基因缺失小鼠也无法区分麻疹病毒野毒株和麻疹病毒减毒疫苗株。

5、因此，亟需找到实验动物易获得，可区分麻疹病毒野毒株和麻疹病毒减毒疫苗株，并且，对麻疹病毒的敏感性不受日龄影响的构建麻疹病毒攻毒动物模型的方法，以用于麻疹病毒野毒株和麻疹病毒减毒疫苗株毒力的评价。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种麻疹病毒攻毒动物模型的构建方法，所述构建方法包括：给干扰素受体缺失动物注射重组腺相关病毒，得到麻疹病毒攻毒动物模型；所述重组腺相关病毒以腺相关病毒为载体表达编码slam受体的基因。

2、在本发明的一种实施方式中，所述编码slam受体的基因的核苷酸序列如seq idno.1所示；所述重组腺相关病毒的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、在本发明的一种实施方式中，所述重组腺相关病毒在干扰素受体缺失动物体内的注射剂量为1×108vg/只~1×1012vg/只。"vg"为vector genomes的缩写，指病毒基因组的数量。

4、在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为干扰素受体缺失大鼠、干扰素受体缺失小鼠、干扰素受体缺失仓鼠或干扰素受体缺失豚鼠。

5、在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为i型干扰素受体缺失动物或ⅱ型干扰素受体缺失动物；所述i型干扰素受体为ifn-αr、ifn-βr和/或ifn-α/βr；所述ⅱ型干扰素受体为ifn-γr。

6、在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为ifnα/βr-/-基因缺失小鼠。

7、在本发明的一种实施方式中，所述构建方法包括：先给干扰素受体缺失动物注射重组腺相关病毒，再给干扰素受体缺失动物注射麻疹病毒，得到麻疹病毒攻毒动物模型。

8、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒在干扰素受体缺失动物体内的攻毒剂量为1×103ccid50/只~1×106ccid50/只。

9、在本发明的一种实施方式中，所述构建方法包括：先给给干扰素受体缺失动物注射重组腺相关病毒，注射重组腺相关病毒30~60天后，再给干扰素受体缺失动物注射麻疹病毒，得到麻疹病毒攻毒动物模型。

10、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒包括麻疹病毒野毒株和/或麻疹病毒减毒疫苗株。野毒株是指从自然界分离获得的保有本来特性的病毒株。减毒疫苗株是指对特定宿主的毒力已被适当减弱或已消失的病毒株。减毒疫苗株能够通过对野毒株进行突变而得。

11、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒减毒疫苗株包括麻疹病毒实验室适应株。实验室适应株是指在实验室中将野毒株通过细胞或组织进行持续传代而得的减毒疫苗株。

12、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒减毒疫苗株包括schwarz株、s-191株、moraten株或edmobston株；所述麻疹病毒野毒株包括mv-1株、mv-3株、mv-9株或cdc-d8株。

13、在本发明的一种实施方式中，所述注射为颅内注射或滴鼻注射；当注射为颅内注射时，所述麻疹病毒攻毒动物模型的受检样本为大脑和/或小脑；当注射为滴鼻注射时，所述麻疹病毒攻毒动物模型的受检样本为肺脏。

14、本发明还提供了一种麻疹病毒攻毒动物模型，所述麻疹病毒攻毒动物模型由上述构建方法构建而得。

15、本发明还提供了一种评价麻疹病毒毒株毒力的方法，所述方法使用上述构建方法构建而得的麻疹病毒攻毒动物模型对麻疹病毒毒株毒力进行评价。

16、在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

17、攻毒步骤：先给干扰素受体缺失动物注射重组腺相关病毒，再给干扰素受体缺失动物注射麻疹病毒；

18、评价步骤：攻毒步骤结束后，检测干扰素受体缺失动物体内的麻疹病毒载量。

19、在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

20、攻毒步骤：先给干扰素受体缺失动物注射重组腺相关病毒，注射重组腺相关病毒30~60天后，再给干扰素受体缺失动物注射麻疹病毒；

21、评价步骤：攻毒步骤结束后，检测干扰素受体缺失动物体内的麻疹病毒载量。

22、在本发明的一种实施方式中，所述编码slam受体的基因的核苷酸序列如seq idno.1所示；所述重组腺相关病毒的核苷酸序列如seq id no.2所示。

23、在本发明的一种实施方式中，所述重组腺相关病毒在干扰素受体缺失动物体内的注射剂量为1×108vg/只~1×1012vg/只；所述麻疹病毒在干扰素受体缺失动物体内的攻毒剂量为1×103ccid50/只~1×106ccid50/只。

24、在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为干扰素受体缺失大鼠、干扰素受体缺失小鼠、干扰素受体缺失仓鼠或干扰素受体缺失豚鼠。

25、在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为i型干扰素受体缺失动物或ⅱ型干扰素受体缺失动物；所述i型干扰素受体为ifn-αr、ifn-βr和/或ifn-α/βr；所述ⅱ型干扰素受体为ifn-γr。

26、在本发明的一种实施方式中，所述干扰素受体缺失动物为ifnα/βr-/-基因缺失小鼠。

27、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒包括麻疹病毒野毒株和/或麻疹病毒减毒疫苗株。

28、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒减毒疫苗株包括麻疹病毒实验室适应株。

29、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒减毒疫苗株包括schwarz株、s-191株、moraten株或edmobston株；所述麻疹病毒野毒株包括mv-1株、mv-3株、mv-9株或cdc-d8株。

30、在本发明的一种实施方式中，所述注射为颅内注射或滴鼻注射；当注射为颅内注射时，所述麻疹病毒攻毒动物模型的受检样本为大脑和/或小脑；当注射为滴鼻注射时，所述麻疹病毒攻毒动物模型的受检样本为肺脏。

31、本发明还提供了上述构建方法构建而得的麻疹病毒攻毒动物模型或上述方法在评价麻疹病毒毒株毒力中的应用。

32、本发明还提供了上述构建方法构建而得的麻疹病毒攻毒动物模型在评价麻疹病毒疫苗有效性、筛选麻疹预防药物或筛选麻疹治疗药物中的应用。

33、在本发明的一种实施方式中，所述麻疹病毒疫苗包括麻疹减毒活疫苗和/或麻疹灭活疫苗。

34、本发明技术方案，具有如下优点：

35、本发明提供了一种麻疹病毒攻毒动物模型的构建方法，包括：给干扰素受体缺失动物注射重组腺相关病毒，得到麻疹病毒攻毒动物模型；所述重组腺相关病毒以腺相关病毒为载体表达编码slam受体的基因。研究发现，注射重组腺相关病毒的干扰素受体缺失小鼠可区分麻疹病毒野毒株和麻疹病毒减毒疫苗株，能够同时适用于麻疹病毒野毒株和麻疹病毒减毒疫苗株的毒力评价；注射重组腺相关病毒的干扰素受体缺失小鼠对麻疹病毒的敏感性受小鼠的年龄影响较小，各日龄阶段均可造模成功；现有的攻毒实验需要通过检测组织中的病毒载量或者进行组织切片以评价麻疹病毒毒株毒力，而使用注射重组腺相关病毒的干扰素受体缺失小鼠可以通过观测存活率以评价麻疹病毒毒株毒力，显著缩短了毒力评价实验的实验周期，同时实验现象观察更直观；仅需对已有干扰素受体缺失小鼠进行注射，无需转基因和基因缺失，培育周期短、易获得且可稳定获得。因此，使用此方法构建而得的麻疹病毒攻毒动物模型在评价麻疹病毒毒株毒力、评价麻疹病毒疫苗有效性、筛选麻疹预防药物或筛选麻疹治疗药物中均极具应用前景。