一种抗人乳头瘤病毒IgY抗体的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种特异性抗人乳头瘤病毒igy抗体制备方法及防治多种hpv血清型毒株感染和肿瘤的预防应用。

背景技术：

1、人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)属于乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒a属，病毒基因组7900对碱基，环状球形双链闭环小dna。hpv直径45～55nm，二十面体立体对称，含72个壳微粒，其被蛋白质包裹，无囊膜，分子量5×106道尔顿。hpv dna有8个开放阅读框，转录一个mrna分子翻译成8种蛋白质，包括衣壳蛋白(l1、l2)和功能性蛋白(e1、e2、e4、e5、e6、e7)。人类皮肤角质形成细胞、黏膜鳞状上皮细胞是hpv的天然宿主。hpv不经血流扩散，不产生病毒血症。hpv各型之间有共同抗原，即属特异性抗原，存在于l1蛋白；l2蛋白为型特异性抗原，l2不变区域携带表面特异性抗原表位，这个表位与宿主细胞膜相互作用病毒进入细胞。hpv各型在l1和l2衣壳蛋白都存在不同程度的抗原交叉反应，抗一种型的hpv抗体能够与许多其他型hpv病毒相互作用达到预防和治疗的广谱性，这将产生意想不到惊奇。如：hpv16型和hpv18型均与其它型hpv有共同抗原，抗hpv16型、或hpv18型抗体能够预防，或治疗其它型hpv引起的皮肤、粘膜、生殖器等疣或肿瘤。

2、目前hpv已经发现200多个基因型，其中有低风险的hpv型，感染皮肤和粘膜产生疣和良性肿瘤；以及致癌高危型的hpv型(hpv5、8-9、14-25、30-31、33、35、39、45、51-53、56、58、59、68、73和82)，其引起外阴癌、阴茎癌、肛门癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等。hpv通过直接或间接接触污染物品，或性传播感染。自然感染产生抗hpv抗体应答较差。hpv具有独特的感染方式，损伤的上皮基底膜被暴露，hpv l1蛋白结合到颗粒层上皮基底膜的硫酸肝素蛋白聚糖(hspgs)上改变其构象，暴露出l2蛋白的n末端，其被弗林蛋白酶裂解，进而使l1和l2的构象重排，使病毒运动到颗粒层角质形成细胞带，其病毒残基暴露上皮于细胞（未分化细胞）内吞基团内吞病毒。感染的细胞开始分化并向上层迁移到上皮层、角质层，最终上皮细胞死亡脱落而hpv被释放腔道再感染新的破损暴露的基底层细胞。hpv天然免疫的逃逸：①、hpv感染的角质细胞正常死亡不引起显著的炎症反应，故不引起免疫反应清除病毒。②、hpv能使干扰素(ifn)、白介素-18(il-18)的表达及作用下调，使nk细胞和巨噬细胞吞噬功能下降。hpv从获得性免疫中逃逸：①、hpv感染组织朗格汉斯细胞(lc)数量减少、结构改变，造成hpv抗原提呈障碍。②、lc接触病毒抗原的机会小。③、hpv降低了cd4+t细胞反应。④、hpv诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)前体细胞耐受。

3、hpv感染易发部位包括外阴、阴道、阴茎、宫颈和肛门周围、肛管内、尿道口，以及腋窝、脐窝、趾间、乳房下、口腔粘膜表面等。hpv几乎没有特效治疗方法。

4、l2衣壳蛋白含有型共同表位，在l2的n端aa 11 ~ 200之间发现了中和表位，该表位在不同类型hpv之间高度保守。varsani等人产生了嵌合体插入hpv16 l2 aa 108-120后组装成vlp的hpv16 l1免疫后诱导产生l2特异性抗体。将免疫血清被动转移到小鼠交叉保护动物免受所有相关假病毒粒子(psv)的阴道黏膜攻击hrhpv(hpv16/18/45/31/33/52/58/35/39/51/59/68/56/73/26/53/66/34)和lrhpv(hpv6/43/44)体内攻击。。

5、由于hpv感染途径是病毒从腔道的损伤上皮直接感染，所以疫苗产生的血液抗体循环对于防治hpv感染效果甚微或无效。而特异性抗hpv抗体局部应用效果肯定，例如：针对多重耐药菌的igy抗体临床试验取得了成功；特异性抗轮状病毒igy治疗人轮状病毒感染疗效显著，减少了腹泻次数；蛋黄抗体能被动免疫防治covid-19感染。

6、鉴于上述理由，制备一种抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv) igy抗体，其能与各型具有共同抗原的hpv结合，被动免疫防治各型hpv引起的皮肤、粘膜表面疣和肿瘤，尽力清除体内hpv，其具有深远的社会效益和重大的经济效益。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种制备特异性抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)的igy抗体的方法，以及所制备的igy抗体，其能与具有共同抗原的各型hpv结合，使用这种igy抗体制剂防治由各型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)引起的人类皮肤、粘膜疣和良、恶性肿瘤等。

2、本发明的目的可以采取以下方法来实现：

3、一种特异性抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv) igy抗体，其能与具有共同抗原的各型hpv结合，其特征是它由以下方法取得：

4、（1）免疫原制备：

5、取重组的hpv 18型病毒l1衣壳蛋白与l2衣壳蛋白n端11-200 aa组成的融合蛋白10~100μg/ml；

6、将等量体积的hpv18型病毒l1与l2衣壳融合蛋白液(比如：10~100μg/ml液体100ml)与等量体积的内含5~10mg/ml活卡介苗福氏完全佐剂(比如：100ml)混合，经高速匀浆机6000rpm搅拌5次，每次3分钟，搅拌乳化至油包水福氏完全佐剂免疫原使用液；

7、将等量体积的hpv18型病毒l1与l2衣壳融合蛋白液(比如：10~100μg/ml液体100ml)与等量体积的福氏不完全佐剂(比如：100ml)混合，经高速匀浆机6000rpm搅拌5次，每次3分钟，搅拌乳化至油包水福氏不完全佐剂免疫原使用液；

8、每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中均含有hpv18型病毒l1与l2 n端11-200 aa组成的融合衣壳蛋白10～100μg；

9、（2）免疫：

10、将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉5～80点注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1ml免疫原，然后每隔1～2周使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉10～60点注射给产蛋母鸡共计四次，此后每隔1～2个月再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉10～30点注射给产蛋母鸡加强免疫至一年；

11、（3）抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv) igy抗体水水稀释法提取物的制备：

12、收集免疫21天后的免疫母鸡的鸡蛋，鸡蛋表面用自开水洗净、70%酒精浸泡，去蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:5～12的比例加蒸馏水搅拌，并用1n hcl调节酸碱度至ph4.9～5.3，在温度4ºc下静置过夜；

13、将蛋黄稀释液在4ºc高速离心15分钟取上清，然后经截留分子量为10~50kda的中空纤维超滤器中超滤浓缩10～20倍，再加入0.02%～5.0%的葡萄糖酸氯已定，并使用1nnaoh调节酸碱度至ph7.0～7.5，且在4ºc静置过夜；此后在4ºc高速离心10分钟取上清，将上清经0.22μ～0.45μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv) igy抗体的水提取物。

14、所述的免疫原制备中的hpv 18型病毒l1衣壳蛋白与l2衣壳蛋白n端11-200aa的融合蛋白10~100μg。

15、所述的免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及spf环境下饲养的莱杭鸡、海兰褐鸡、罗曼鸡、明星鸡、以及家养的土鸡。

16、（4）抗人乳头瘤病毒 igy抗体纯品的制备：

17、抗人乳头瘤病毒 igy抗体纯品的制备步骤是在抗人乳头瘤病毒 igy抗体水稀释法提取物的制备程序之后的延续过程，其步骤是：将igy抗体水稀释法制备的提取物经葡萄糖酸氯已定处理后的抗人乳头瘤病毒igy抗体提取物加硫酸胺至45%~60%的饱和度，硫酸铵粉末边加边搅拌，充分搅拌溶解混匀后，室温静置2～12小时，然后在高速离心机4ºc离心10分钟，弃上清取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再缓慢加硫酸胺粉末至28%~35%的饱和度，硫酸铵粉末边加边搅拌，充分搅拌溶解混匀后，室温静置2～12小时，然后在高速离心机4ºc离心10分钟，弃上清取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，igy溶液再采用中空纤维超滤膜超滤除盐，即得抗人乳头瘤病毒igy抗体纯品。

18、按本发明的方法制备的抗人乳头瘤病毒igy抗体水稀释法提取物的igy纯度，经sds-page电泳测定，其igy抗体的纯度达到30%-35%；而经本发明方法两步硫酸铵沉淀法制取的抗人乳头瘤病毒igy抗体纯品的igy纯度，经sds-page电泳测定，igy抗体的纯度达到85%-92%。

19、按本本发明的方法提取的抗人乳头瘤病毒igy抗体水稀释法提取物的igy生物学效价经elisa（酶联免疫吸附实验）方法测定，特异性抗人乳头瘤病毒igy抗体的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗人乳头瘤病毒抗原的igy抗体结合生物学效价为1:2048~4096/mg蛋白。

20、按本本发明的方法提取的抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)igy抗体两步硫酸铵沉淀法制取的纯品igy生物学效价经elisa（酶联免疫吸附实验）方法测定，特异性抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)抗体的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)抗原的igy抗体结合生物学效价为1:8192~16384/mg蛋白。

21、按本发明的方法制取的特异性抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)igy抗体还包括如下步骤：加入药学上可接受的附加剂制成含有抗人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)igy抗体的喷雾剂、气雾剂、含漱液、洗液、栓剂。

22、按本发明的方法制取的特异性抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)igy抗体局部施于口腔及咽喉、支气管、外阴、阴道，以及全身皮肤、粘膜等处，其既无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不吸收、不破坏鼻腔、口腔、咽喉、支气管、外阴、阴道，以及全身皮肤、粘膜等处的正常微生态环境，且无毒副作用。抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)igy抗体提取物不产生急性毒性反应和慢性毒性反应，属于实际无毒级；抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)igy抗体提取物三致试验阴性，属于无致畸、致癌、致突变的制品。