一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种高产生物膜的工程菌株：解淀粉芽孢杆菌lpn-18nfen36的构建及应用。

背景技术：

1、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)是芽孢杆菌属、产孢子的兼性厌氧型革兰氏阳性菌，细胞多呈杆状，广泛分布于食物、水、植物表面和动物肠道以及土壤环境等多个生态系统。迄今为止，解淀粉芽孢杆菌由四个种属组成：解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)，暹罗芽孢杆菌(b.siamensis)，贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)和中村芽孢杆菌(b.nakamurai)。尽管解淀粉芽孢杆菌由不同的菌株组成，具有不同的性质和用途，但就菌株安全角度而言，它们被认为是一种安全、无毒且可应用于生产的工业微生物。1998年，解淀粉芽孢杆菌已被美国食品和药物管理局(fda)认定为安全微生物(generally recognized as safe,gras)，可应用于食品工业和动物饲料的发酵生产中。随着高通量测序技术的发展，目前已完成全基因簇测序的解淀粉芽孢杆菌有50余株，其中形成生物膜，生成芽孢和分泌抗菌肽是它们的共性，随着功能基因簇的挖掘和研究进一步开展，解淀粉芽孢杆菌的生物功能和待开发的工业应用逐渐被明晰，其在食品加工、生物制药和环境治理方面具有广泛的应用前景。而作为一种著名的根际微生物，其在农业生产的作物增产和病虫害防御方面已有广泛的研究，在其发挥植物促生中，生物膜使其与作物黏附、发挥生物促生作用的前提，因此研究解淀粉芽孢杆菌生物膜合成，优化其合成路径具有重要意义。

2、生物膜(biofilm)是由微生物分泌出的胞外基质将自身包裹而形成的一种聚集体，能够帮助其附着于生物或非生物体表面。生物膜被认为是地球上最广泛和最成功的生命模式之一，在大多数自然环境中，生物膜也是微生物最主要的生活方式。目前研究表明，生物膜可以保护微生物免受极端环境的影响，可以提高微生物对紫外线辐射、极端温度和ph、金属离子、营养匮乏、抗生素等不良条件的耐受性。生物膜对不良环境的耐受性能够为微生物种群创造合适的栖息地，使得微生物之间物质和信息的交换更加稳定，因此是微生物在自然环境中生长的一种自我保护机制。生物膜中微生物的形态结构及其对环境因素的敏感性和生物学特性与浮游微生物也都有所不同，生物膜的三维结构为微生物提供了天然的屏障和保护层。此外，胞外基质中的固定微生物比浮游微生物更能抵御外界不良环境。在农林业中，定殖于植物根际或植物内的细菌、真菌等各类微生物，会与植物组成一种植物-微生物共生体，而生物膜能够帮助微生物更好的提高自身在复杂环境中的生存竞争能力，是生防细菌占据生态位的重要存在形式，能够帮助其抵御不良环境，同时筑起一道防止植物病原微生物入侵的“围墙”，以此来适应和抵御外界环境的压力。

3、srna(small srna)是一种长约50-500nt的基因表达调控因子，在细菌中通过与靶基因或靶蛋白配对结合，调控细菌的生理功能应对各种环境变化。作为一类重要的生理生化调控因子，在细菌中普遍存在且高度保守。关于srna的研究在革兰氏阴性细菌的细胞膜合成研究较为透彻，而在革兰氏阳性菌的生物膜合成调控作用知之甚少。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，本发明的工程菌株展现出高生物膜合成能力，其在农作物促生增产和维持根系健康生长中具有良好的应用前景。

2、本发明还提供所述基因工程菌的构建方法与应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，将非编码rna fen36转化到解淀粉芽孢杆菌所得。

4、非编码rna fen36的dna序列如下：

5、>seq id no.1

6、caatgataaaggattgcagagactctaatgagacgtagatgacgttttt

7、tccttcggcttttccgaagtagacgttgttcggcacgtcatagttggcc

8、ttcatatagttttccacatccgttacatcgcttgaatcggcaagcgcgc

9、gctggctgtttgatttcacattctgcacggcatcgtaaatcgtaaagtt

10、gtacgtgcccaagtatttcaccagatagtttcggtcaaatgagcgtgtc

11、aaaagctcaggacgatcggattccgcgacggcgaggttgatcaggaa

12、cacaagcacggcggaagccaaaacgattctgaatgatttcttcgccgg

13、tttttcagccgtttttttcatcttaag

14、作为优选，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌lpb-18n。

15、本发明所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

16、(1)将基因fen36融合至表达载体pht43，得到重组载体pht43-fen36；

17、(2)将重组载体pht43-fen36转化至解淀粉芽孢杆菌，得到生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌。

18、其中，步骤(1)中以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，设计引物扩增fen36序列，pgrac的扩增模板来自表达载体pht43，利用bamhⅰ和kpnⅰ双酶切，酶切验证成功后将其作为模板进行pcr扩增启动子片段。将扩增的pgrac片段与非编码rna fen36通过重叠验证pcr连接，待验证成功后，采用无缝克隆进行融合片段(pgrac-fen36)与表达载体pht43连接，经氯霉素和氨苄霉素的双重筛选，获得重组载体pht43-fen36。

19、其中，步骤(1)中引物如下：

20、fen36-f：cgattacaaaaacatcagccgtaggatcctctagcaatgataaaggatt

21、fen36-r：gacgtcgactctagaggatcctacgcttaagatgaaaaaaacggctgaaa

22、pgracf：gatgacctcgtttccaccggaattagcttggtaccagctattgtaac

23、pgracr：agagtctctgcaatcctttatcattgggatcctacggctgatgtttttgtaatcg

24、本发明所述的生物膜高产的解淀粉芽孢杆菌基因工程菌在农作物促生增产和维持根系健康生长中的应用。

25、本发明所述功能非编码fen36对解淀粉芽孢杆菌的生物膜合成具有正向调控中的应用。

26、本发明所述非编码rna fen36基因在促进生物膜形成中的应用。

27、其中，所述非编码rna fen36的过表达能促进解淀粉芽孢杆菌生物膜形成中的应用。

28、其中，所述解淀粉芽孢杆菌为lpb-18n。

29、本发明基于前期的生物信息学筛选分析，通过同源重组技术构建了生物膜的高产菌株解淀粉芽孢杆菌lpb-18nfen36(非编码rna fen36的过表达)，生物膜形成的结晶紫分析结果显示，菌株lpb-18nfen36的生物膜形成能力增加3.59倍，细胞的运动能力增强，且维持着解淀粉芽孢杆菌lpb-18n的抗菌脂肽fengycin高产性能，以上生理特性说明工程菌株解淀粉芽孢杆菌lpb-18nfen36具有植物病虫害防护、植物根系附着以及促生增长的潜在功能，将在农业生产中具有良好的应用前景。

30、本发明通过同源重组技术构建非编码rna fen36的过表达菌株，突变菌株的生物膜合成量分析检测发现，与出发菌株解淀粉芽孢杆菌lpb-18n相比，非编码rna fen36的过表达使得生物膜产量提高3.59倍，结合对突变菌株的细胞运动性，抗菌脂肽产量以及卓越的生物膜形成特性，该菌株在植物生防以及植物促生方面具有良好的应用潜力。

31、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

32、(1)本发明通过对转录组学数据的生物信息学预测，并对靶非编码rna进行分子功能验证，从转录后调控途径的角度首次探究了非编码rna对解淀粉芽孢杆菌lpb-18生物膜的合成调控作用。相比于转录前调控，转录后调控更复杂，且在解淀粉芽孢杆菌的生物膜合成代谢中研究报道较少。本发明中的非编码rna fen36是一段新型调控片段，关于其在细菌代谢中的作用也未被报道。

33、(2)本发明通过过表达非编码基因rna fen36构建得到基因工程菌解淀粉芽孢杆菌lpb-18nfen36兼具抗菌脂肽fengycin分泌和生物膜合成性能，生物膜形成量相比于出发菌株解淀粉芽孢杆菌lpb-18n提高了3.59倍，其在植物的病虫害防治和作物根部促生中具有良好的应用前景。