利用生物酶法高效制备莱鲍迪苷M的方法与流程

本发明属于生物催化转化，具体涉及一种利用生物酶法高效制备莱鲍迪苷m的方法。

背景技术：

1、人们发现以甜菊糖苷为代表的一类绿色、健康的天然甜味剂可以广泛的作为代糖使用。甜菊糖苷是从甜叶菊(s.rebaudiana)的叶片中通过植物提取法得到的天然甜味剂。甜叶菊产地源自于南美巴拉圭和巴西的原始森林，几百年以来，当地人一直将甜叶菊的叶子研磨后作为甜味剂使用，这种甜味主要是源于叶子中含有的多种甜菊醇醇糖苷混合物。甜菊糖苷是由一些二萜类糖苷化合物形成的糖苷混合物，它的化学结构是糖配体与甜菊醇苷元连接缩合，甜菊糖苷中的糖苷键大部分无法消化，因此释放的能量很少，可以成为非常有吸引力的糖替代品。甜叶菊叶片中含量最丰富的是甜菊苷(stevioside)和莱鲍迪苷a(rebaudiosidea)，其甜度是蔗糖的200倍，是最早开始商业化使用的甜味剂。然而，甜菊苷和莱鲍迪苷a会作用于味蕾中的苦味受体htas2r4和htas2r14，导致其具有明显的后苦味，口感不好，而这降低了人们对二者的接受度，影响了其应用范围及市场接受度。甜叶菊叶片中含量非常少(0.3％)的莱鲍迪苷m具有快速、纯正的甜味且热量极低，在感官特性上与蔗糖最为相似，在食品、医药行业非常具有研究意义，有望代替蔗糖这一传统糖源作为天然甜味剂来广泛使用，被誉为下一代甜味剂。

2、目前商业化的产品莱鲍迪苷a甜味味质不如莱鲍迪苷m，然而甜叶菊中口感最佳的莱鲍迪苷m在甜叶菊中严重缺乏，天然含量非常低，不可能像含量高的甜菊苷和莱鲍迪苷a一样，直接从甜叶菊叶片进行商品化的提炼和纯化，这限制了莱鲍迪苷m的大批量规模化生产和供给。通过转基因甜叶菊或者微生物法来生产莱鲍迪苷m可以提高其产量，但以上两种方法均需要充分了解莱鲍迪苷m的生物合成途径，特别是糖基化过程。

3、目前甜菊糖苷的生物合成途径已经基本明晰，并鉴定出了一系列利用尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose，udpg)作为糖基供体的糖基转移酶(ugts)。分析莱鲍迪苷m生物合成途径可以发现，位于莱鲍迪苷a的c19-羧基方向的糖基化，即在该位置形成β(1-2)糖苷键，是生成莱鲍迪苷m的必需步骤，决定了莱鲍迪苷m的天然含量大小。甜菊糖苷的糖基化依赖于位于甜叶菊(s.rebaudiana)细胞质中的4个糖基转移酶(ugts)。它们在碳水化合物活性酶(cazy)数据库(www.cazy.org)中均被标注为gt1家族成员，并利用尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose)作为糖基供体。糖基转移酶ugt85c2和ugt74g1分别在甜菊醇苷元的c13羟基和c19羧基位置上以β-1糖苷键连接第一个葡萄糖基，接着ugt91d2通过β(1-2)糖苷键在第一个葡萄糖基的c2添加一个糖基，最后ugt76g1在第一个葡萄糖基的c3位添加一个糖基。张等发现甜叶菊自身缺乏在甜菊糖苷c19-羧基方向形成β(1-2)糖苷键的能力，是造成甜菊糖苷dm天然含量低的直接原因。

4、目前以莱鲍迪苷a作为底物经糖基化反应生成莱鲍迪苷m，通常需要经过两步转化，首先莱鲍迪苷a糖基化生成莱鲍迪苷d，然后再进一步糖基化生成莱鲍迪苷m，两步催化法生成莱鲍迪苷m的缺点是容易造成中间产物莱鲍迪苷d的累计，不利于后续分离提纯，并且两步法催化莱鲍迪苷a生成莱鲍迪苷m通常需要多种酶，步骤较为繁琐。

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6、通常udp-糖基供体依赖的糖基转移酶(ugts)催化的糖基化反应需要使用价格昂贵且稳定性差的udp-糖基供体，如udp-葡萄糖(udpg)等，udpg过于昂贵，作为糖基供体使用会产生巨额的成本，不适用于大规模的工业化生产，这严重限制了ugts的工业化应用。

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8、天津大学申请的专利cn110734944b-一步法合成莱鲍迪苷m的方法，该发明以莱鲍迪苷a为底物，加入尿苷二磷酸葡萄糖，硫酸镁或氯化镁，甲醇，利用能够分泌表达糖基转移酶的重组工程菌ugt1和ugt2催化反应，得到莱鲍迪苷m，该方法添加了较多的金属离子和有机溶剂，不利于后续的的分离纯化和食品级生产，且反应中添加了昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖，生产成本过高。南京工业大学申请的专利cn109750071a-一种生物催化合成莱鲍迪苷m的方法，该申请是利用番茄来源udp-糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以甜菊甙为原料糖基化反应合成莱鲍迪苷e；随后，利用甜叶菊来源udp-糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以莱鲍迪苷e为原料进一步糖基化反应合成莱鲍迪苷m，该方法需要先生成莱鲍迪苷e，再进一步生成莱鲍迪苷m。该方法需要经过两步或多步催化反应才能得到最终产物，反应速度慢，催化效率低，副产物较多，不利于分离纯化。

9、因此目前现有生产莱鲍迪苷m的技术中，存在如下的缺点：

10、1)植物提取法步骤繁琐，产量低，成本高，分离提纯困难。

11、2)植物提取法需要大量的甜叶菊，浪费耕地面积。

12、3)化学合成法产生大量有害气体和废液，不利于环境保护。

13、4)催化反应体系中含有较多的金属离子和有机溶剂，不利于后续的的分离纯化和食品级生产。

14、5)需要经过两步或多步催化反应才能得到最终产物，反应速度慢，催化效率低，副产物较多，不利于分离纯化。

15、6)通常所需糖基供体为昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖，生产成本高，不适合大规模的工业化生产。

16、7)需要添加多种酶制剂进行催化反应，特异性差，产率较低。

17、所以亟需一种高效低成本生产莱鲍迪苷m的方法。

技术实现思路

1、为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供利用生物酶法高效制备莱鲍迪苷m的方法。

2、本发明提供的方法是基于基因挖掘的方法得到糖基转移酶，然后构建工程菌进行蛋白表达，体外催化以莱鲍迪苷a作为底物进行糖基化反应一步合成莱鲍迪苷m。该合成方法催化效率高反应时间短，产物单一易分离，有较大的工业应用前景。并且本发明提供的糖基转移酶还可与蔗糖合成酶进行偶联催化，以蔗糖作为糖基供体，将莱鲍迪苷a一步催化生成莱鲍迪苷m。

3、本发明提供的利用生物酶法高效制备莱鲍迪苷m的方法通过使用催化效率较高的糖基转移酶，能够以莱鲍迪苷a为底物，一步催化生成莱鲍迪苷m，实现莱鲍迪苷m的高效生物合成。该方法可以避免中间产物莱鲍迪苷d的生成，便于后续的分离提纯，精简催化反应的工艺流程。该方法用生物酶法高效合成制备高甜度低热量天然甜味剂-莱鲍迪苷m。

4、本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

5、本发明提供的一种利用生物酶法高效制备莱鲍迪苷m的方法，包括如下步骤：

6、将莱鲍迪苷a、尿苷二磷酸葡萄糖、糖基转移酶、盐加入缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在搅拌状态下进行酶催化反应，得到所述莱鲍迪苷m。

7、进一步地，在所述混合液中，莱鲍迪苷a的浓度为1-100g/l；

8、优选地，在所述混合液中，莱鲍迪苷a的浓度为1g/l。

9、进一步地，在所述混合液中，尿苷二磷酸葡萄糖的浓度为0.5-20mm；

10、优选地，在所述混合液中，尿苷二磷酸葡萄糖的浓度为1mm。

11、进一步地，所述盐为钙盐、钴盐、铁盐、镁盐、锰盐、铵盐、镍盐、锌盐中的一种以上；

12、优选地，所述盐为钙盐、镁盐、锰盐、铁盐中的一种以上；

13、进一步优选地，所述盐为镁盐。

14、进一步地，在所述混合液中，盐的浓度为0.1-10mm；

15、优选地，在所述混合液中，盐的浓度为1mm。

16、进一步地，所述缓冲液的ph为5.0-9.0；

17、优选地，所述缓冲液的ph为6.0-8.0；

18、进一步优选地，所述缓冲液的ph为8.0；

19、进一步地，所述在搅拌状态下的搅拌速率为50-220rpm；

20、优选地，所述在搅拌状态下的搅拌速率为200rpm。

21、进一步地，所述酶催化反应的温度为20-45℃，所述酶催化反应的时间为1-5h。

22、优选地，所述酶催化反应的温度为30-37℃。

23、进一步优选地，所述酶催化反应的温度为37℃。

24、进一步地，在所述混合液中，所述糖基转移酶的浓度为1-20g/l；

25、优选地，在所述混合液中，所述糖基转移酶的浓度为5g/l。

26、进一步地，所述糖基转移酶的序列为如seq id no.1所示、如seq id no.2所示、如seq id no.3所示、如seq id no.4所示、如seq id no.5所示、如seq id no.6所示、如seqid no.7所示、如seq id no.8所示、如seq id no.9所示、如seq id no.10所示、如seq idno.11所示及如seq id no.12所示的氨基酸序列中的一种以上。

27、优选地，所述糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

28、本发明提供的方法中，使用的糖基转移酶催化糖基化反应效率较高，以尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)作为糖基供体，该酶可以很好地催化莱鲍迪苷a糖基化一步生成高价值甜味剂莱鲍迪苷m，且不需要添加其他任何酶。

29、本发明提供的方法中，使用的糖基转移酶的糖基化反应的最适ph为8.0，最佳反应温度为37℃，是一种金属离子依赖型酶，mg2+、ca2+、mn2+对该酶的催化效率有明显的促进提升作用，其中mg2+的促进作用最强。

30、本发明提供的方法中，该酶的最佳反应条件为：反应体系各种物质的终浓度分别是莱鲍迪苷a为1g/l，udpg为1mm，mgcl2为5mm，反应温度37℃，转速220rpm，反应时间1-2h，在最佳反应条件下，该酶催化莱鲍迪苷a糖基化生成莱鲍迪苷m的催化效率较高，转化率可达95％以上。

31、本发明提供的另一种利用生物酶法高效制备莱鲍迪苷m的方法，包括如下步骤：

32、将莱鲍迪苷a、蔗糖、udp(5-尿苷二磷酸二钠盐)、糖基转移酶、蔗糖合成酶、盐加入缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在搅拌状态下进行酶催化反应，得到所述莱鲍迪苷m。

33、进一步地，在所述混合液中，莱鲍迪苷a的浓度为1-100g/l；

34、优选地，在所述混合液中，莱鲍迪苷a的浓度为10g/l。

35、进一步地，在所述混合液中，蔗糖的浓度为1-500mm；

36、优选地，在所述混合液中，蔗糖的浓度为100mm。

37、进一步地，在所述混合液中，udp(5-尿苷二磷酸二钠盐)的浓度为0.1-20mm；

38、优选地，在所述混合液中，udp(5-尿苷二磷酸二钠盐)的浓度为2mm。

39、进一步地，所述盐为钙盐、钴盐、铁盐、镁盐、锰盐、铵盐、镍盐、锌盐中的一种以上；

40、优选地，所述盐为钙盐、镁盐、锰盐、铁盐中的一种以上；

41、进一步地，在所述混合液中，盐的浓度为0.1-10mm；

42、优选地，在所述混合液中，盐的浓度为0.1-5mm。

43、进一步优选地，在所述混合液中，盐的浓度为1mm。

44、进一步地，所述缓冲液的ph为4.0-9.0；

45、优选地，所述缓冲液的ph为6.0-8.0；

46、进一步优选地，所述缓冲液的ph为8.0；

47、进一步地，所述在搅拌状态下的搅拌速率为50-220rpm；

48、优选地，所述在搅拌状态下的搅拌速率为200rpm。

49、进一步地，所述酶催化反应的温度为20-45℃，所述酶催化反应的时间为1-5h。

50、优选地，所述酶催化反应的温度为30-37℃。

51、进一步优选地，所述酶催化反应的温度为37℃。

52、进一步地，在所述混合液中，所述糖基转移酶的浓度为1-20g/l；

53、优选地，在所述混合液中，所述糖基转移酶的浓度为5g/l。

54、进一步地，所述糖基转移酶的序列为如seq id no.1所示、如seq id no.2所示、如seq id no.3所示、如seq id no.4所示、如seq id no.5所示、如seq id no.6所示、如seqid no.7所示、如seq id no.8所示、如seq id no.9所示、如seq id no.10所示、如seq idno.11所示及如seq id no.12所示的氨基酸序列中的一种以上。

55、优选地，所述糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

56、进一步地，在所述混合液中，所述蔗糖合成酶的浓度为1-10g/l；

57、优选地，在所述混合液中，所述蔗糖合成酶的浓度为2g/l。

58、进一步地，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列为如seq id no.13所示、如seq idno.14所示、如seq id no.15所示、如seq id no.16所示、如seq id no.17所示、如seq idno.18所示、如seq id no.19所示及如seq id no.20所示中的一种以上。

59、优选地，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列如seq id no.13所示。

60、本发明提供的第二种利用生物酶法高效制备莱鲍迪苷m的方法，是以蔗糖作为糖基供体，在udp存在的条件下，该糖基转移酶可以与蔗糖合成酶进行偶联催化，使莱鲍迪苷a一步生成高价值甜味剂莱鲍迪苷m，无其他中间产物或副产物生成。该方法中，双酶偶联催化反应的最适ph为8.0，最佳反应温度为37℃，mg2+对该偶联催化反应的催化效率有明显的促进提升作用。该方法中，双酶偶联催化的反应时间短，2h内莱鲍迪苷a即被全部转化生成莱鲍迪苷m。

61、该方法利用糖基转移酶和蔗糖合成酶的偶联催化作用，以蔗糖为糖基供体取代昂贵的udpg，高效催化ra一步生成rm，从而降低生产成本。

62、本发明提供的两个方法中，均使用了催化效率较高的糖基转移酶，能够以莱鲍迪苷a为底物，一步催化生成莱鲍迪苷m，实现莱鲍迪苷m的高效生物合成。这两个方法可以减少体系中的金属离子、副产物等杂质，降低分离纯化的成本，以实现莱鲍迪苷m的绿色生物合成。

63、本发明提供的第二个方法中，是以廉价的蔗糖作为糖基供体，大幅度降低生产成本。

64、与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

65、(1)本发明实施例提供的方法中，使用的酶在最佳反应条件下可以高效催化莱鲍迪苷a一步生成莱鲍迪苷m，催化过程中不需要添加其他酶，能够专一性的催化糖基化反应生成莱鲍迪苷m，无中间产物或其他副产物，且反应时间短，催化效率高，产物莱鲍迪苷m的得率可达95％以上，有利于产物的分离提纯；

66、(2)本发明实施例提供的方法中，通过双酶偶联催化可以在最佳反应条件下将莱鲍迪苷a一步催化生成莱鲍迪苷m，无副产物产生，专一性较好，有利于后续的产物分离提纯，以蔗糖作为糖基供体，生产成本低，有利于莱鲍迪苷m大规模生物合成；

67、(3)本发明实施例提供的方法中，反应终体系中只含有微量金属离子(mg2+)，无中间产物或副产物，杂质含量极低且易分离，有利于工业化规模生产的后续分离纯化。