一种肺炎克雷伯菌slyA基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用

本发明属于生物，涉及一种肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用。

背景技术：

1、高毒力肺炎克雷伯菌(hvkp)具有感染任何年龄的健康个体的能力，以及感染患者呈现多部位感染和/或随后发生转移性传播的倾向，从而导致传染性综合征的发生，包括非肝性脓肿、肺炎和坏死性筋膜炎等。最近，hvkp菌株可通过获取抗性质粒或通过将抗性元件插入其毒力质粒获得抗菌耐药基因(cr-hvkp)，cr-hvkp株引起的致命性爆发的报道令人高度关注，但未得到控制。抗生素治疗是目前一种常见的方法，鉴于cr-hvkp不断增加，我们需要新的策略来控制和预防肺炎克雷伯菌的感染。接种疫苗是另一项预防传染病的关键战略，并且保留了病原菌刺激人体免疫系统的特性。目前基于荚膜多糖(cps)、脂多糖(lps)和蛋白质等，针对肺炎克雷伯菌的疫苗方案包括全细胞疫苗、核糖体疫苗和毒力因子。全细胞疫苗中的减毒疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫，使机体获得较广泛的免疫保护，并且无需要添加佐剂，尽管生物安全问题限制了活疫苗的使用，但是它们可以扩大免疫效果，增强群体免疫屏障。

2、因此，有必要开发一种可以诱导强大的体液免疫反应预防肺炎克雷伯菌感染的新疫苗。

技术实现思路

1、为了解决所述技术问题，本发明提供了一种肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用，本发明的疫苗可以诱导强大的体液免疫反应。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株的制备方法，所述方法包括：

4、以高毒力肺炎克雷伯菌ntuh-k2044株dna为模板，分别以seq id no.1-2的引物扩增获得上同源片段，以seq id no.3-4的引物扩增获得下同源片段；

5、将所述上同源片段和所述下同源片段以seq id no.1和seq id no.3为引物进行扩增，获得同源臂融合片段；

6、将融合的同源臂片段连接到t载体后，获得含同源臂的质粒；

7、将含cas9的质粒转入肺炎克雷伯菌ntuh-k2044的感受态中，获得含cas9肺炎克雷伯菌ntuh-k2044感受态；

8、将seq id no.9所示的sgrna和所述含同源臂的质粒转化至所述含cas9肺炎克雷伯菌ntuh-k2044感受态中，获得δslya缺失菌株，即肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株。

9、在本发明的第二方面，提供了所述方法制备得到的肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株。

10、在本发明的第三方面，提供了一种肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗，包括所述的肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株以及药学上接受的佐剂。

11、进一步地，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、mpl tm、il-12、氢氧化铝联合cpg odn复合佐剂、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐剂中的至少一种。

12、在本发明的第四方面，提供了所述的疫苗株和/或所述的疫苗在制备预防人类和动物中肺炎克雷伯菌感染的疫苗中的应用。

13、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

14、本发明提供的一种肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用，本发明通过筛选获得了一种可以对抗hvkp(肺炎克雷伯菌)感染的减毒活疫苗，在构建slya缺失菌株后，通过研究δslya菌株作为减毒活疫苗的保护效果，发现δslya菌株可以诱导强大的体液免疫反应，并提供对hvkp感染的保护。我们发现δslya菌株可作为一种新的候选疫苗的潜力，以及对肺炎克雷伯菌感染的抵抗能力。

技术特征：

1.一种肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

2.一种采用权利要求1所述方法制备得到的肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株。

3.一种肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗，其特征在于，包括权利要求2所述的肺炎克雷伯菌slya基因缺失减毒活疫苗株以及药学上接受的佐剂。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、mpl tm、il-12、氢氧化铝联合cpg odn复合佐剂、isa51vg、isa720vg、mf59、qs21、as03佐剂中的至少一种。

5.权利要求2所述的疫苗株和/或权利要求3-4所述的疫苗在制备预防人类和动物中肺炎克雷伯菌感染的疫苗中的应用。

技术总结
本发明提供了一种肺炎克雷伯菌slyA基因缺失减毒活疫苗株及其制备方法与应用，所述疫苗株的制备方法包括：以肺炎克雷伯菌NTUH‑K2044的DNA为模板，分别以SEQ ID NO.1‑2的引物扩增获得上同源片段，以SEQ ID NO.3‑4的引物扩增获得下同源片段；将所述上、下同源片段以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3为引物扩增，获得同源臂融合片段后连接到T载体后，获得含同源臂的质粒；将SEQ ID NO.9所示的sgRNA和含同源臂的质粒转化至含Cas9的K2044感受态中，获得ΔslyA缺失菌株，该菌株可诱导强大的体液免疫反应，可作为一种新的抵抗肺炎克雷伯菌感染的候选疫苗。

技术研发人员：周英顺,梁清华,罗金晶,候小峰,胡仁静
受保护的技术使用者：西南医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16