一种嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法及应用

本技术涉及生物医药，尤其是涉及一种嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、嗅神经母细胞瘤(esthesioneuroblastoma，enb)，一种病因未明的、罕见的、起源于嗅神经上皮原始基底细胞的神经外胚层恶性肿瘤，占鼻腔鼻窦肿瘤的3％～6％。常见发病部位多为鼻腔上部，如鼻中隔上部，上鼻甲，筛板。enb发病年龄覆盖范围大，呈双峰表现，分别在11～20岁和51～60岁，发病无明显性别差异。enb病变中心早期局限于鼻腔，呈局部浸润性生长，后期可逐渐侵袭邻近组织和器官，主要淋巴结和血液进行远处转移，常见的转移部位位颈部淋巴结、肺和骨骼等。enb起病较为隐匿，患者临床表现与肿瘤生长密切相关，早期往往缺乏特异性的临床症状，就诊时多为中晚期。因此手术联合放疗为主的综合治疗是目前enb最佳的治疗模式，对于高级别期的enb患者，可在术后辅助化疗。

2、目前对于enb研究主要从临床病理学入手，观察其临床特点及相关治疗方式的预后估计。虽然有研究表明病理类型与预后相关，但至今仍未形成规范的临床治疗决策。关于enb的分子病理学研究十分缺乏。通过组学分析可以揭示其复杂的致病过程，一些研究表明在少数已知癌症基因中存在复发性基因组畸变或体细胞突变，但对于该疾病的预测及预后能力有限。受制于体外细胞系及体内动物模型的缺乏，对enb这一疾病的发生发展机制，癌症治疗及高通量药物筛选等相关研究开展也十分有限。

3、患者源性肿瘤类器官(patient-derived tumor organoids，pods)是近年来体外研究的一种新兴技术，指提取并分离患者体内原发性肿瘤细胞，通过模拟肿瘤细胞基质环境进行3d培养，从而形成肿瘤类器官。这一类型的肿瘤类器官相较于传统的人源性组织异种移植模型在遗传学上更高程度保留了原发肿瘤的特征，因此可以用于抗肿瘤药物筛选或观察各种临床治疗方式的效果。此外，还可以运用基因编辑技术对其进行改造，从而研究肿瘤发生发展机制及其与肿瘤微环境之间联系。

4、目前关于患者源性的嗅神经母细胞瘤类器官的构建及使用方法尚未见相关报道。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法及应用，本技术的构建方法可操作性强、重复性好，结合消化酶消化和传代培养的方法，可以实现类器官的传代扩增及长期保存，填补了目前嗅神经母细胞瘤原代细胞培养缺陷的情况，解决了现有技术中嗅神经母细胞瘤培养基及培养方法等问题，实现培养出能够高度保留患者源性嗅神经母细胞瘤遗传特性的3d类器官目的，从而为后续该疾病机制研究、临床疗效预测、高通量药物筛选提供可能，因此具有良好的使用推广的价值。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基，包括以下浓度的组分：

4、基础培养基advanced dmem/f12，5～10mm hepes，1～4mm glutamax，5～20μm y-27632，50～200u/ml青霉素-链霉素溶液，0.5～2×b27，1～1.5mm n-乙酰-l-半胱氨酸，5～20mm烟酰胺，25～100ng/ml human egf，6～15ng/ml human fgf-10，2.5～7.5ng/ml humanfgf basic，250～1000nm a83-01，0.5～1.5μm pge2，1.5～4.5μm chir-99021，0.5～1.5μmforskolin，60～150ng/ml重组human r-spondin-3蛋白，25～60ng/ml重组noggin蛋白，50～150μg/ml primocin，0.5～2.5μg/ml两性霉素b和20～50ug/ml庆大霉素。

5、本技术使用的pge2即前列腺素e2(prostaglandin e2)，可以调节许多生理系统.在类器官培养过程中，加入pge2，其与特异性受体结合后可以介导细胞增殖、分化，可以提高嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官的培养成功率。

6、本技术使用的chir-99021是一种糖原合成酶激酶3β抑制剂，可诱导人胚胎干细胞向内胚层分化，同时chir-99021还是wnt3a信号通路激活剂，用于本技术类器官培养中可以促进细胞存活，提高成功率。

7、本技术的发明人经过大量创造性劳动，获得上述浓度组分组成的嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基，本技术的培养基基于嗅神经母细胞瘤生长特点，选择多种细胞因子并按一定浓度配比而成，使所获得的类器官培养基中含有适量的信号通路调节因子，包括wnt信号通路激活剂r-spondin 3和noggin，成纤维细胞生长因子2和10，同时辅以烟酰胺、乙酰半胱氨酸、rock抑制剂等小分子，有效促进嗅神经母细胞瘤类器官的增殖以及功能维持。

8、作为本技术所述嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基的优选实施方式，所述类器官培养基包括以下浓度的组分：

9、基础培养基advanced dmem/f12，2mm hepes，2mm glutamax，10μmy-27632，100u/ml青霉素-链霉素溶液，1×b27，1.25mm n-乙酰-l-半胱氨酸，10mm烟酰胺，50ng/ml humanegf，10ng/ml human fgf-10，5ng/ml human fgf basic，500nm a83-01，1μm pge2，3μmchir-99021，1μm forskolin，100ng/ml重组human r-spondin-3蛋白，40ng/ml重组noggin蛋白，100μg/ml primocin，2.5μg/ml两性霉素b和25ug/ml庆大霉素。

10、第二方面，本技术提供了一种嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法，包括以下步骤：

11、s1、取嗅神经母细胞瘤肿瘤组织样本破碎，使用消化液对肿瘤组织样本进行消化，然后离心，取沉淀；

12、s2、将步骤s1获得的沉淀与基质胶重悬，铺板后加入所述的嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基培养，每2-4天更换类嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基；

13、s3、定期记录类器官的生长状态，每10-14天进行传代和冻存。

14、优选地，收集的嗅神经母细胞瘤肿瘤组织样本来自嗅神经母细胞瘤原发灶的手术切除组织或活检组织，样本体积直径约1cm，样本收集过程中应尽可能避免暴露于外界环境中，减少污染。

15、作为本技术所述嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法的优选实施方式，所述消化液包括以下浓度的组分：

16、基础缓冲液hbss，10～20u/ml中性蛋白酶，1.0～2.5mg/ml胶原酶，5～20μmy-27632，300～500u/ml青霉素-链霉素溶液，15～25μg/ml两性霉素b，150～250ug/ml庆大霉素和3～5μg/ml卡泊芬净。

17、本技术所使用的y-27632是rho相关丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的小分子特异性抑制剂，可以抑制g1-s期细胞周期进行和胞质分裂，在消化液中加入y-27632可以有效降低干细胞的凋亡，提高克隆效率，延长细胞传代次数，从而提高后续培养的成功率。

18、本技术所使用的两性霉素b是一种多烯类抗真菌药，对多种致病真菌具有体外抗菌活性，其可以通过破坏真菌细胞壁的合成有效抵抗真菌污染。卡泊芬净是一种多肽类抗真菌药，其可抑制许多丝状真菌和酵母菌细胞壁主要成分1,3-β-d-葡聚糖的合成，导致细胞壁结构异常，具有广谱抗真菌活性。庆大霉素是一种氨基糖苷类广谱抗生素，其可于细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。由于本技术中使用临床标本来自鼻腔上部，其与外界接触较为密切，在处理阶段使用上述高浓度抗生素可以有效杀灭和抑制细菌真菌的生长。

19、本技术结合优化后的消化液及类器官模型的构建方法，可以有效提高嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型培养的成功率，并且在较短时间内获得与亲本肿瘤组织在遗传性状和组织形态上相近的肿瘤类器官，同时解决了嗅神经母细胞瘤原代细胞难以培养等问题。

20、作为本技术所述嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤s1中，嗅神经母细胞瘤肿瘤组织样本破碎前，浸泡于提前预冷的肿瘤组织保存液中，4℃下静置30～60min；

21、所述肿瘤组织保存液包括以下浓度的组分：

22、基础培养基advanced dmem/f12，10mm hepes，2mm glutamax，10μmrock抑制剂y-27632，300μg/ml原代细胞抗生素primocin，500u/ml青霉素-链霉素溶液，25μg/ml两性霉素b，250μg/ml庆大霉素和5μg/ml卡泊芬净。

23、优选地，所述步骤s1中，取嗅神经母细胞瘤肿瘤组织样本置于6cm细胞培养皿中，使用手术剪将其切成1～3mm2小块，然后加入2～3ml消化液，37℃消化40-60min，消化期间每隔10～15min使用巴氏吸管上下吹打混合物10～20次，直至观察到出现2～10个细胞构成的细胞团时，即为达到消化终点。

24、优选地，所述步骤s1还包括肿瘤组织样本消化后清洗的步骤，加入红细胞裂解液，4℃孵育15～20min，离心，使用预冷的dpbs清洗后取沉淀。沉淀应使用100μm过滤器过滤。

25、优选地，所述步骤s3中，基质胶的用量取决于原代肿瘤细胞量，大约每300,000个细胞与100μl基质胶混匀。混匀后，应将基质胶与细胞混合物滴加在提前预热的细胞培养板中，每滴约为10μl。将培养板翻转置于37℃，5％co2的培养箱中，静置30～60min，待基质胶凝固后再加入嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基进行培养。

26、作为本技术所述嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法的优选实施方式，所述传代步骤为：去除类嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基，加入预冷的advanced dmem/f12+++，吹打破碎基质胶，离心后弃上清，加入消化酶重悬，常温消化，期间吹打消化，当出现2-10个细胞簇时，即为达到消化终点，中止消化，4℃离心取上清，后续铺板加入如权利要求1或2所述的嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基进行培养；

27、所述advanced dmem/f12+++包括以下浓度的组分：

28、基础培养基advanced dmem/f12，100u/ml青霉素-链霉素溶液，10mm hepes，2mmglutamax；10μm y-27632。

29、作为本技术所述嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法的优选实施方式，所述冻存步骤为：传代培养2～5天后，去除类嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基，加入预冷的advanced dmem/f12+++，机械破碎后，加入消化酶消化，离心取沉淀，使用细胞冻存液重悬，然后加入细胞冻存液，置于-80℃温度下，48小时后转移到液氮中；

30、所述advanced dmem/f12+++包括以下浓度的组分：

31、基础培养基advanced dmem/f12，100u/ml青霉素-链霉素溶液，10mm hepes，2mmglutamax；10μm y-27632。

32、作为本技术所述嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法的优选实施方式，细胞冻存液包括以下浓度的组分：10％ dmso，90％ fbs，10μm y-27632。

33、作为本技术所述嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法的优选实施方式，所述嗅神经母细胞瘤肿瘤组织样本的大小为1～3mm2。

34、嗅神经母细胞瘤复苏的具体操作步骤为：将液氮冷冻保存的嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官转移到37℃中，水浴孵育1～3min，低温离心后，弃上清加入预冷的上述肿瘤组织保存液，混匀后离心去沉淀，后续种板步骤同嗅神经母细胞瘤原代类器官种板步骤。

35、第三方面，本技术提供了上述构建方法制备得到的嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型。

36、第四方面，本技术提供了嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型在药物体外筛选、药敏检测中的应用。

37、本技术在嗅神经母细胞瘤类器官的培养过程中，通过光学显微镜观察、he染色、免疫荧光以及外显子测序等技术手段进行验证，所培养的嗅神经母细胞瘤类器官在遗传特性、细胞形态和蛋白表达上均高度保留嗅神经母细胞瘤亲本组织的肿瘤特异性。

38、本技术通过构建一种嗅神经母细胞瘤类器官模型，进行药敏试验等可以用于制定临床个性化治疗。此外，该模型还可作为一项工具研究enb的发生发展过程，并在肿瘤分子标志物筛选、新药研究等方面发挥重要作用，从而更加有利于实现基础向临床的转化，探索更为有效的临床治疗策略。

39、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

40、本技术提供了一种嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官模型的构建方法及应用，本技术中所使用的嗅神经母细胞瘤肿瘤类器官培养基、消化液等试剂均遵循严格的试剂配比，可操作性强，重复性好。嗅神经母细胞瘤原代类器官在经过传代及冻存复苏后仍可保持良好的生长状态，其遗传特性也与亲本类似，解决了嗅神经母细胞瘤体外传代的长期保存的问题；并且本技术所提供的嗅神经母细胞瘤类器官，可作为放化疗的体外实验样本，快速地预测和评估临床治疗方案的有效性，实现个体化精准治疗；此外，可以作为嗅神经母细胞瘤体外基础研究模型，探究疾病的发生机制，寻求相关治疗靶点，具有良好的实际应用推广之价值。