一种针对SFTSV-Gn和CD3的双特异性抗体及其制备方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体及其制备方法。

背景技术：

1、发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus，sftsv)是一种导致人体患伴有发热、血小板减少和白细胞减少等综合性症状的病原体，已经成为公共卫生严重威胁。sftsv的病毒颗粒附着在细胞膜上，通过糖蛋白和宿主细胞之间的相互作用进入细胞，其中gn/gc糖蛋白广泛地介导它进入人类和动物细胞系。感染后的潜伏期通常为5至14天。发热、胃肠道不适、血小板减少，在极端情况下，胰腺损伤、心肌损伤，甚至中枢神经系统病变和脑炎，都是常见的临床表现。

2、病毒感染伴有抗病毒免疫反应的损害。t淋巴细胞是介导细胞免疫反应的主要免疫细胞。对sftsv的血清学反应缺陷已被发现与疾病的发病率和病死率相关，而t细胞损伤会导致抗病毒免疫的破坏。在sftsv感染的早期过程中，t细胞缺乏，特别是在严重疾病的患者，患者t细胞的丢失伴随免疫检查点分子的上调，急性sftsv感染期间免疫细胞上的程序性细胞死亡蛋白1(pd1)，t细胞呈现重度耗竭的表型，这些结果显示发热伴感染急性期患者特别是后续发生死亡的患者中t细胞抗病毒免疫被明显的损害。

3、现有可用于治疗sftsv的药物有法匹拉韦、硼替佐米(ps-341)和六氯酚等，均属于核苷酸类似物。法匹拉韦是一种吡嗪衍生物，根据法匹拉韦的小鼠实验，它证明了法匹拉韦提高了在sftsv感染的致死模型中的存活率，而不会导致体重减轻，并降低了血清中的病毒载量，该治疗方法将可用于常规的临床应用；硼替佐米(ps-341)是一种二肽硼酸类似物，是一种fda批准的高选择性可逆性蛋白酶体抑制剂，已被证明具有抗病毒活性。对ps-341的研究表明，ps-341处理降低了易感细胞中sftsv的增殖，并抑制了sftsv的复制和释放以及nss介导的rig-i的降解。数据显示，ps-341通过诱导细胞凋亡来抑制sftsv的复制；六氯酚是通过elisa对fda许可的1528种药物进行筛选所得到的一种抗病毒化合物，其活性最好。根据机制研究，六氯酚通过干扰细胞膜融合来阻止sftsv进入宿主细胞，通过分子对接研究，预测了六氯酚与sftsv gc糖蛋白i和iii结构域之间的疏水区的高度稳定结合，六氯酚新发现的抗病毒特性和机制将使其能够作为一种先导分子，进一步增加抗sftsv活性和降低药物毒性。

4、核苷酸类似物的作用机制是它通过与天然核苷酸竞争反转录酶的结合位点而发挥作用，由于与天然核苷酸的结构相似，核苷酸类似物可与反转录酶结合并成为合成中的病毒dna链的一部分，一旦与病毒基因结合，核苷酸类似物即阻止其他核苷酸进入合成中的dna链，从而终止病毒基因的复制。但是核苷酸类似物仅能抑制病毒复制而不是杀灭病毒，停药后容易复发，所以需要长期服用，没有确定的疗程。而且这类药物可引起病毒耐药变异，一旦出现耐药就需要调整治疗方案；如果出现多重耐药，进一步治疗就会非常棘手。

5、除了小分子核苷酸类似物药物外，研究人员还利用类固醇治疗、静脉注射免疫球蛋白或血浆置换等方法，但这些方法均表现出治疗效果较差和作用机制不明确等特点，还有可能增加并发症的风险。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，通过t细胞接合器双特异性抗体(bispecific t-cellengager，bite)可以同时结合sftsv感染细胞膜上的病毒gn包膜蛋白和t细胞上的cd3受体将t细胞重定向到感染细胞并杀死感染细胞，从而发挥抗病毒作用。

2、本发明提供一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3中的一种。

3、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为seq id no：1，所述特异性抗体包括il-2信号肽、anti-gn scfv、cd3-scfv和his标签区；

4、所述anti-gn scfv为3a5-scfv；

5、所述il-2信号肽的氨基酸序列为seq id no：4；

6、所述3a5-scfv的氨基酸序列为seq id no：11；

7、所述cd3-scfv的氨基酸序列为seq id no：5；

8、所述his标签区的氨基酸序列为seq id no：6。

9、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为seq id no：2，所述特异性抗体包括il-2信号肽、anti-gn scfv、cd3-scfv和his标签区；

10、所述anti-gn scfv为mab45-scfv；

11、所述il-2信号肽的氨基酸序列为seq id no：4；

12、所述mab45-scfv的氨基酸序列为seq id no：21；

13、所述cd3-scfv的氨基酸序列为seq id no：5；

14、所述his标签区的氨基酸序列为seq id no：6。

15、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述双特异性抗体的氨基酸序列为seq id no：3，所述特异性抗体包括il-2信号肽、anti-gn scfv、cd3-scfv和his标签区；

16、所述anti-gn scfv为5d4-scfv；

17、所述il-2信号肽的氨基酸序列为seq id no：4；

18、所述5d4-scfv的氨基酸序列为seq id no：31；

19、所述cd3-scfv的氨基酸序列为seq id no：5；

20、所述his标签区的氨基酸序列为seq id no：6。

21、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述anti-gn scfv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用ggggsggggsggggs连接子连接。

22、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述cd3-scfv的氨基酸序列的轻链和重链之间采用ggggsggggsggggs连接子连接。

23、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述anti-gn scfv的氨基酸序列的轻链和所述cd3-scfv的氨基酸序列的重链之间采用ggggs连接子连接。

24、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述his标签区的氨基酸序列和所述cd3-scfv的氨基酸序列的重链之间采用串联融合表达的方式连接。

25、根据本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，所述针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体用于制备治疗sftsv的药物。

26、本发明还提供一种如上所述针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：

27、s1：以sftsv康复病人的血液为样本，建立用于筛选特异性结合sftsv包膜蛋白gn的噬菌体展示抗体库；

28、s2：通过筛选，获得anti-gn scfv序列，用于构建cd3双特异性抗体表达载体；

29、s3：在pfuse的起始密码子之后插入il-2信号肽序列，在pfuse的终止密码子之前插入his标签，获得pfuse真核表达载体；

30、s4：将所述anti-gn scfv序列与ggggs连接子通过pcr的方法连接到cd3-scfv中，获得pcr产物；

31、s5：通过无缝克隆的方法将所述pcr产物构建到所述pfuse真核表达载体中，获得单克隆体；

32、s6：对所述单克隆体进行测序验证，测序验证无误后，提取重组质粒；

33、s7：将所述重组质粒转染到293f悬浮细胞中，待5～7天后，以4000rpm/min进行离心，提取上清液；

34、s8：将所述上清液进行过滤，获得滤液，将所述滤液与咪唑进行混合，获得第一混合液，将所述第一混合液通过akta蛋白纯化仪纯化，获得sftsv-gn和cd3的双特异性抗体。

35、本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果之一：

36、1、本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体的制备方法制备的双特异抗体，由于是两种scfv串联而成，不存在fc段，使得其组装效率高。传统抗体需要轻重链的结合，而本发明制备的双特异性抗体由于不存在fc段，即没有重链，因此不存在抗体轻重链错配的问题，避免了引起病毒耐药变异而增加并发症的问题。

37、2、本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体可以高亲和力地靶向结合有gn蛋白表达的sftsv感染细胞，治疗效果稳定。

38、3、本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体与cd3具有结合作用，亲和力良好，可以较好对t细胞进行活化的同时又不会因为持续活化t细胞而导致细胞因子风暴，可显著提高cd3端双特异性分子的安全性。

39、4、本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体，由于其t细胞接合器双特异性抗体主要在感染急性期杀死感染细胞，因此bite设计上缺乏fc段可避免由于fc段引起较长的抗体半衰期引发系统免疫副作用的风险，同时bite形式分子量较小易于递送到感染部位的优点，作用机制明确，且具有适应于临床需求的药代动力学性质。

40、5、本发明提供的一种针对sftsv-gn和cd3的双特异性抗体能有效的介导t细胞对sftsv感染细胞的杀伤作用，且杀伤作用显著。

41、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。