突变CSGG孔的制作方法

本发明涉及一种新型蛋白孔及其用途。特别地，其涉及在核酸测序应用及分子感测中的生物纳米孔。本发明涉及csgg的突变形式。本发明还涉及采用csgg的分析物检测和表征。

背景技术：

1、蛋白孔是形成膜中通道的跨膜多肽和复合物，离子和某些分子可以通过该通道。所述通道的最小直径典型的处在纳米范围内(10-9米)，因此将这些多肽中的某些命名为“纳米孔”。

2、纳米孔具有作为生物传感器的巨大潜力。当结合在膜上的纳米孔被施加电势时，离子从所述通道中流过。该离子流可以作为电流被测量。例如，wo2000/28312和d.stoddartet al.,proc.natl.acad.sci.,2010,106,7702-7中描述了使用单通道记录设备的合适的电学检测技术。例如，wo2009/077734中描述了多通道记录技术。

3、通过所述孔，或结合到所述孔中或接近所述孔的分子转录用于阻碍并从而降低通过所述通道的离子流。离子流的降低程度指示孔内或其附近的阻塞的尺寸，该离子流降低程度通过电流的下降进行测量。因此被测量的电流可以用于测量通道阻塞的大小或程度。电流的变化可以用于识别分子或分子的一部分已经在所述孔(分子传感)或接近所述孔或在特定体系中结合，其可以用于基于分子大小测定位于孔内分子的身份(核酸测序)。

4、“链测序”方法是已知的采用生物纳米孔对核酸进行测序的方法。将单链多核苷酸通过纳米孔，当它们瞬时穿过纳米孔通道时，每个核苷酸上的碱基通过检测电流的变化进行测定。该方法相对于核酸测序的传统方法节省了大量时间和成本。

5、之前报道的蛋白纳米孔，例如突变体mspa(manrao et al.,naturebiotechnology,2012,30(4),349-353)以及α-溶血素纳米孔(nat.nanotechnol.,2009,4(4),265-70)已经用于使用“链测序”方法的核酸测序。相似地，对于蛋白传感其他孔例如α-溶血素(j am chem soc,2012,134(5),2781-7)和clya(am.chem.soc.nano.2014,8(12),12826-35)(j.am.chem.soc,2013,135(36),13456-63)也已经被采用。

6、对克服现有技术缺陷的新型纳米孔的需求依然存在，尤其是优化用于分子传感应用和例如核酸测序应用的孔的维度和特征。

7、纳米孔传感是一种依靠观察个体结合或分析物分子和受体间相互作用的传感方法。纳米孔传感器可以通过在绝缘膜中放置纳米维度的单孔并测量在分析物分子存在下通过该孔的电压驱动的离子传输而产生。分析物的识别通过其独特的电流信号、显著的持续时间和电流块的范围以及电流水平的变化显示出来。

8、现在存在对快速且便宜、应用范围广泛的核酸(例如dna或rna)测序技术的需求。现有技术速度慢并且价格昂贵主要是因为其依赖扩增技术产生大量核酸并需要大量的用于信号检测的专用荧光化学物质。纳米孔传感有潜力通过减少核苷酸和所需试剂用量而提供一种快速且便宜的核酸测序方法。

9、采用纳米孔传感进行核酸测序的两个必要组分是(1)控制核酸移动通过该孔；和(2)核酸聚合物移动通过孔时对核苷酸的识别。在过去，为实现核苷酸的识别，使核酸穿过溶血素的突变体。这会提供电流信号，该电流信号显示是由序列决定的。这也表明当使用溶血素孔时，大量的核苷酸有助于观测电流，使得观测电流和多核苷酸之间的直接关系令人深思。

10、虽然通过溶血素孔的突变已经改善了用于识别核苷酸的电流范围，但是如果核苷酸之间的电流差异进一步提高，则测序系统将具有更好的性能。另外，观察到，当核酸移动通过孔时，某些电流状态表现出高变化性。还显示，某些突变溶血素孔比其他的展现出更高的变化性。虽然这些状态的变化可以包含序列的特异性信息，但是希望产生具有低变化性的孔来简化该系统。还期望减少有助于观测到的电流的核苷酸的数量。

技术实现思路

1、发明人已经鉴定出细菌淀粉样蛋白分泌通道csgg的结构。所述csgg通道是一种跨膜寡聚蛋白，其形成最小直径约为0.9nm的通道。csgg纳米孔的结构使其适合用于蛋白质传感应用中，特别是用于核酸测序。csgg多肽的修饰变体可以用于进一步增强所述通道对上述特定应用的适用性。

2、因为其结构更适合于dna测序应用，csgg孔较现有蛋白质孔例如clya或α-溶血素具有优势。csgg孔具有更有利的纵横比，包括比clya具有更短的跨膜通道。csgg孔与α-溶血素孔相比具有更宽的通道开口。对于某些应用，这可以促进酶的附着，例如对于核酸测序应用。在这些实施方式中，其也可以使位于酶和读取头(定义为孔的最窄部分)之间的核酸链段的长度最小化，从而导致改善的读出信号。在涉及核酸测序的本发明的实施方式中，csgg孔的通道中狭窄的内部收缩结构(constriction)还促进单链dna的易位。所述收缩结构由两个环形环组成，这两个环形环通过相邻蛋白质单体中位置51处的酪氨酸残基(tyr 51)以及分别在位置56和55处的苯丙氨酸残基和天冬酰胺残基(phe 56和asn 55)并置而形成。所述收缩结构的尺寸可以被修改。clya具有更宽的内部收缩结构，使得目前没有用于测序的双链dna通过。所述α-溶血素孔不仅具有一个1.3nm宽的内部收缩结构，同时还具有一个2nm宽的具有额外读取头特征的β-桶结构。

3、在第一方面，本发明涉及一种用于分子传感的方法，其包括：

4、a)提供一种由绝缘层内的至少一种csgg单体形成的csgg生物孔；

5、b)在所述绝缘层上施加电势，从而建立通过所述生物孔的电流；

6、c)使所述csgg生物孔与测试底物接触；以及

7、d)测量流过所述生物孔的电流。

8、典型地，所述绝缘层为一种膜，例如磷脂双分子层。在一种实施方式中，通过所述孔的电流是由从所述绝缘层的第一侧流到所述绝缘层的第二侧的可溶性离子流携带。

9、在本发明的一种实施方式中，所述分子传感为分析物检测。在特定实施方式中，分析物检测的方法包括在步骤(d)之后的另外的步骤：通过与测试底物不存在时通过所述生物孔的电流相比，通过所述生物孔的电流减少，确定出测试底物的存在。

10、在本发明一种替代的实施方式中，所述分子传感是核酸测序。典型地，通过所述方法测序的核酸种类为dna或rna。在本发明特定的实施方式中，所述csgg生物孔适合于容纳额外的辅助蛋白。典型地，所述额外的辅助蛋白为选自以下的核酸加工酶：dna或rna聚合酶；异构酶；拓扑异构酶；促旋酶；端粒酶；核酸外切酶；和解旋酶。

11、在本发明的实施方式中，所述csgg生物孔为一种修饰的csgg孔，其中所述修饰的csgg孔对所述csgg孔的至少一个csgg单体中的单体野生型大肠杆菌csgg多肽序列至少具有一种修饰。典型地，对形成所述csgg孔的所有csgg单体进行相同的修饰。在本发明具体的实施方式中，所述修饰的csgg单体具有根据seq id no：4至388的从位置38至63的多肽序列。

12、在第二方面，本发明涉及修饰的csgg生物孔，包括至少一个csgg单体，其中所述修饰的csgg生物孔具有不多于一个的通道收缩结构，所述收缩结构的直径范围为0.5nm至1.5nm。典型地，所述修饰在所述csgg单体多肽序列的位置38至63之间。合适的，所述修饰处于选自以下的位置：tyr51；asn55；和phe 56。在具体的实施方式中，所述修饰为在tyr 51位置，或在asn55和phe56两个位置。

13、在本发明的实施方式中，对所述csgg单体的修饰选自以下：自然存在的氨基酸的取代；自然存在的氨基酸的缺失；和自然存在的氨基酸侧链的修饰。合适地，所述修饰降低或除去未修饰氨基酸的空间阻碍。在具体的实施方式中，所述孔的至少一个csgg单体具有根据seq id no 4至388的从位置38至63的多肽序列。

14、在第三方面，本发明涉及分离的多肽，所述多肽编码本发明第二方面的修饰的csgg生物孔的至少一种csgg单体。

15、在第四方面，本发明涉及分离的核酸，所述核酸编码本发明第三方面的分离的多肽。

16、在第五方面，本发明涉及一种生物传感器，包括：

17、a)绝缘层；

18、b)在所述绝缘层中的csgg生物孔；以及

19、c)用于测量通过所述生物孔电流的设备。

20、在具体实施方式中，在所述生物传感器中的所述csgg生物孔为根据本发明第二方面所述的修饰的csgg生物孔。

21、在第六方面，本发明涉及用于生物传感应用的csgg生物孔的用途，其中所述生物感应应用为分析物检测或核酸测序。

22、本发明第六方面的一种实施方式中，所述核酸测序为dna测序或rna测序。

23、发明人意外地证明，csgg及其新突变体可用于表征分析物，例如多核苷酸。本发明涉及突变csgg单体，其中进行一个或多个修饰以提高所述单体与分析物，例如多核苷酸，相互作用的能力。发明人还意外的证明，包含新型突变单体的孔具有增强的与分析物，例如多核苷酸，相互作用的能力，并因此表现出用于评估分析物特性(例如多核苷酸序列)的改进的性能。所述突变孔意外的显示出改善的对核苷酸的鉴别。特别地，突变孔意外的显示出增加的电流范围，这使其更容易区分不同的核苷酸，并减少会增加信噪比的状态变化。另外，多核苷酸移动通过所述孔时促成电流的核苷酸数量降低。这使得确定多核苷酸移动通过孔时观察到的电流与多核苷酸之间的直接关系更加容易。另外，所述突变孔可以显示出增加的通量，例如，更可能与分析物，例如多核苷酸，相互作用。这使得采用所述孔表征分析物更加容易。所述突变孔可以更容易地插入膜。

24、因此，本发明提供一种包含seq id no：390所示序列变体的突变型csgg单体，其中所述变体包含在y51，n55和f56中的一个或多个位置处的突变。

25、因此，本发明提供一种包含seq id no：390所示序列变体的突变型csgg单体，其中所述变体包括以下的一种或多种：(i)在以下位置的一个或多个突变(即在一个或多个以下位置的突变)n40，d43，e44，s54，s57，q62，r97，e101，e124，e131，r142，t150和r192；(ii)在y51/n55，y51/f56，n55/f56或y51/n55/f56的突变；(iii)q42r或q42k；(iv)k49r；(v)n102r，n102f，n102y或n102w；(vi)d149n，d149q或d149r；(vii)e185n，e185q或e185r；(viii)d195n，d195q或d195r；(ix)e201n，e201q或e201r；(x)e203n，e203q或e203r；和(xi)一个或多个以下位置的缺失：f48，k49，p50，y51，p52，a53，s54，n55，f56和s57。

26、本发明还提供：

27、-包含两个或多个共价连接的csgg单体的构建体，其中至少一个单体是本发明所述的突变型单体；

28、-编码本发明突变型单体或本发明构建体的多核苷酸；

29、-一种衍生自包含本发明的相同突变型单体或本发明的相同构建体的csgg的同源寡聚孔；

30、-一种衍生自包含至少一个本发明突变型单体或至少一个本发明构建体的csgg的异源寡聚孔；

31、-用于确定目标分析物的存在、不存在或一种或多种特性的方法，包括：

32、a)将目标分析物与csgg孔或其突变体接触，以使所述目标分析物相对于所述孔移动；和

33、b)所述分析物相对于所述孔移动时获取一个或多个测量值并因此确定所述分析物的存在、不存在或其一种或多种特性；

34、-一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括形成csgg孔或其突变体和多核苷酸结合蛋白之间的复合物，并从而形成用于表征目标多核苷酸的传感器；

35、-用于表征目标多核苷酸的传感器，包括csgg孔或其突变体和多核苷酸结合蛋白之间的复合物；

36、-csgg孔或其突变体在确定目标分析物存在、不存在或一个或多个特性中的应用；

37、-一种用于表征目标分析物的试剂盒，包括(a)csg孔或其突变体，以及

38、(b)膜的组分；

39、-一种用于表征样品中目标分析物的设备，包括(a)多个csgg孔或其突变体和(b)多个膜；

40、-表征目标多核苷酸的方法，包括：

41、a)使所述多核苷酸与csgg孔或其突变体、聚合酶和标记的核苷接触，以使磷酸标记物(phosphate labelled specie)通过聚合酶顺序添加到目标多核苷酸，其中所述磷酸标记物含有对每个核苷酸特异性的标记；以及

42、b)采用所述孔检测所述磷酸标记物并从而表征所述多核苷酸；和

43、生产本发明所述突变单体或本发明所述构建体的方法，包括在合适的宿主细胞中表达本发明所述的多核苷酸并从而产生本发明所述的突变单体或构建体。