一种基于hiPSC分化的药物检测模型及其构建方法

本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种基于hipsc分化的药物检测模型及其构建方法。

背景技术：

1、人体生理、病理和药理学研究，是生命科学研究的重要部分，传统的二维细胞培养模式在研究人体病理、药理学方面取得了很多成就，但是这些简单的模型难以体现人体器官复杂的生理功能。现有的动物实验存在周期长、成本高、争议大等缺点，而且动物实验往往不能准确反映人体对于各项研究指标的响应。

2、医药公司投入十几年时间和几十亿美元，才有可能开发一种可以投入市场的新药。目前药物开发的主要方法是培养皿中的细胞培养和动物实验，由于人体绝对不等于70公斤的老鼠或百千万个细胞，这使得这些实验并不能很好的预测人体器官对药物的反应。即便是通过了早期临床实验，也有大约90％的新药在临床实验中失败。2016年全球在研抗癌新药数量达到4176种。医药行业需要更好的药物疗效预测工具，使得新药快速、低成本的进入药物筛选流程。

3、人诱导多能干细胞(hipsc)具有和胚胎干细胞相同水平的自我更新能力和多向分化潜能，同时又可有效规避伦理问题和免疫排斥问题，因而成为了近年来干细胞研究领域的热点。然而hipsc在由制备到分化的各个研究环节中存在的效率问题严重限制了其在药物筛选等领域的应用。

4、近年来，生物制造技术被越来越多地应用于hipsc研究中，通过构建具有更高仿生水平的细胞外微环境来优化hipsc的制备、扩增和分化性能。一般地，有三种常用方法在体外模拟细胞和微组织的体内微环境：三维细胞培养、体外细胞共培养及微流控细胞芯片。

5、三维细胞培养是指在包含三维结构的微器件内培养细胞，从而对组织和器官特定微结构进行模拟的一种细胞培养方式。与二维细胞培养不同，三维细胞培养是通过使用微组装结构并调节复杂的环境参数来促进细胞分化和组织生长。

6、体外细胞共培养(co-culture)是将两种细胞(可以来自同一种组织，也可以来自不同的组织)混合共同培养，从而使其中一种细胞的形态和功能稳定表达，并维持较长时间。该技术能模拟体内生成的微环境，便于更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点，填补了单层细胞培养和整体动物实验的鸿沟。

7、微流控细胞芯片是一种微型化人工器官，可以模拟人体微环境下的细胞相互作用，为疾病诊断、治疗和药物筛选等提供了新的途径。它是由微制造技术、细胞生物学、材料科学和力学等学科交叉融合而成，具有高通量、高精度和可重复性等优点。

8、虽然，如何将上述三种方法予以整合，提升体外药筛模型的仿生程度，已经成为近年来药筛研究的热点问题之一。但是，直至目前仍旧没有一种能够突破传统方式来进行药物筛查的有效方法。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供了一种基于三维细胞培养、体外细胞共培养和微流控细胞芯片三种技术构建新型体外药物筛选模型的方法及由此构建的药物筛选模型。

2、为此，本发明提供了一种基于hipsc分化的药物检测模型的构建方法，包括以下步骤：

3、1、hipsc的三维细胞培养；

4、2、采用三维细胞打印方法打印hipsc，构建hipsc三维扩增、上皮-间质转化(emt)及分化的三维微环境；

5、3、hipsc三维扩增、emt及分化形成特定的细胞团簇；

6、4、将细胞团簇灌注到微流控芯片上与人血管内皮细胞灌流共培养，构建药物检测模型；

7、5、确定目标药物，向芯片培养基中加入药物，进行药物药效及毒性检测。

8、在本发明构建药物筛选模型的方法中，在一定程度上整合了目前药物筛选研究中常用的三种生物制造技术，即三维细胞培养技术、体外细胞共培养技术和微流控细胞芯片技术。

9、在本发明优选的实施方案中，所述的hipsc是由人外周血单个核细胞(hpbmcs)通过四因子法逆转录制备而成的。

10、在本发明更加优选的实施方案中，所述四因子使用附加体型载体搭载oct4、sox2、c-myc和klf4四个转录因子。

11、在本发明优选的实施方案中，步骤1中hipsc的三维细胞培养是通过无滋养层(feeder-free)培养方法培养的。

12、在本发明更加优选的实施方案中，使用10倍pbs稀释的玻连蛋白常温包被未经组织培养处理的孔板过夜，然后将hipsc克隆接种至孔板表面，每天使用预热的mtesr1完全培养基进行换液，每4天使用不含酶消化试剂的relesr对hipsc进行克隆式传代。

13、在本发明进一步优选的实施方案中，mtesr1完全培养基包括mtesr1培养基，100u/ml青链霉素双抗以及5μg/ml支原体预防试剂。

14、在本发明优选的实施方案中，步骤2中采用2％～5％质量体积浓度的羟丙基改性甲壳素(hpch)作为打印墨水的基材，墨水中添加10％～40％体积分数的matrigel基质胶作为活性添加剂。

15、在本发明更加优选的实施方案中，采用2.5％质量体积浓度的羟丙基改性甲壳素(hpch)作为打印墨水的基材，墨水中添加20％体积分数的matrigel基质胶作为活性添加剂。

16、在本发明更加优选的实施方案中，使用环氧丙烷作为羟丙基化试剂，在低温、碱性环境中与甲壳素反应不同时间以制备羟丙基改性甲壳素(hpch)。

17、在本发明进一步优选的实施方案中，在制备完成后，通过对产物羟丙基取代度和脱乙酰度的测定，选定适宜的反应时间，制备得到具有低脱乙酰度和高羟丙基取代度的羟丙基改性甲壳素(hpch)。

18、在本发明优选的实施方案中，步骤2中采用的三维细胞打印方法包括激光诱导转移打印、喷墨打印、直接喷嘴挤出打印和诱导交联打印。

19、激光诱导转移打印即为激光诱导产生液滴的喷射过程。其原理为：激光脉冲加热初始基面和转移材料的界面，使得分界面处的转移材料温度升高并汽化，汽化产生的蒸气压压迫前方的材料脱离基片并喷射而出。

20、喷墨打印是利用压电效应或热效应在喷嘴末端产生气泡，进而产生推力并将微液滴喷射在造型台上。

21、直接喷嘴挤出式打印是材料在料仓中的活塞、螺杆、气体等产生的推力下，从喷嘴挤出成丝直接堆积成形的过程。

22、诱导交联打印是指喷嘴挤出打印形成微丝及定型时，伴随着打印材料的凝胶或者交联。

23、其中，交联方法有光交联、离子交联和温控交联。

24、交联处理方式有预交联(在打印前对材料进行交联处理)、原位交联(又名同步交联，在打印材料快出丝时进行交联处理)和后交联(在喷嘴挤出材料微丝后进行交联)。

25、在本发明优选的实施方案中，步骤2中的打印hipsc是使用单细胞状态的hipsc进行打印。

26、在本发明更加优选的实施方案中，单细胞状态的hipsc的制备包括，使用relesr将hipsc消化为克隆状态后，向离心分离出的hipsc克隆中加入stempro accutase消化液，在37℃水浴中震荡5分钟，将hipsc克隆进一步消化为单细胞状态，再次离心后，使用含10μmrock inhibitor y-27632的mtesr1完全培养基重悬得hipsc单细胞悬液。

27、在本发明优选的实施方案中，hipsc单细胞悬液与打印墨水材料混合前，统计hipsc单细胞悬液的细胞密度，然后与打印墨水混合并配制成实验细胞密度。

28、在本发明更加优选的实施方案中，实验细胞密度为1×106个/ml。

29、本发明步骤2中形成的三维微环境对于hipsc的克隆形成具有促进作用。

30、本发明步骤2中使用的三维细胞打印培养体系的优势在于可以实现高倍率的扩增，并且扩增后的hipsc可维持了良好的全能性水平。

31、在本发明优选的实施方案中，步骤3中hipsc分化形成的细胞团簇包括神经胶质样细胞、肝样细胞和肾样细胞团簇。

32、在本发明更加优选的实施方案中，hipsc分化形成的细胞团簇为肝样细胞簇。

33、在本发明优选的实施方案中，步骤4中首先在微流控芯片第一流道中接种并构建内皮细胞层，再将hipsc分化的细胞团簇取出并重新包被在凝胶中、注入微流控芯片第二流道中，第一流道与第二流道存在物质交换。

34、在本发明优选的实施方案中，步骤5中加入药物的方法可以是自动化方式或者手动方式，药物可以是静态或动态作用于模型。

35、在本发明优选的实施方案中，步骤5中目标药物包括美妥珠单抗和美妥昔单抗。

36、在本发明更加优选的实施方案中，步骤5中目标药物为美妥珠单抗。

37、在本发明优选的实施方案中，步骤5中的药物药效及毒性检测包括检测药物的亲和效应和药物的免疫效应。

38、在本发明更加优选的实施方案中，使用体外肿瘤细胞迁移试验和侵袭试验检测药物的亲和效应，使用adcc试验和蛋白表达试验检测药物的免疫效应。

39、本发明再一方面提供了根据本发明所述的方法制备的基于hipsc分化的药物检测模型。

40、在本发明优选的实施方案中，所述药物检测模型为肝癌模型、肝模型和肝药筛查模型。

41、在本发明更加优选的实施方案中，肝癌模型使用肝癌细胞(smmc-7721)构建。

42、有益效果

43、本发明通过采用上述技术方案，获得了以下的有益效果：

44、1、基于三维细胞打印培养，通过调整打印体系的墨水成分，可实现hipsc的规模化高倍扩增，解决了现有技术难以快速规模化扩增的问题；

45、2、利用三维细胞培养、团簇尺寸控制和emt的诱导提升了hipsc向内胚层分化的效率；

46、3、基于hipsc分化的细胞团簇，可构建具有仿生结构的体外三维微流控药物筛选模型，该模型可用于新药的药效检测。

47、4、将本发明构建的模型用于新药美妥珠单抗的肝毒性和肝癌药效检测，相比于常规二维模型，基于该模型测得的肝毒性和药效学结果与体内实验结果具有更高的相似性。