一种检测动物Q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的引物对和探针组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及病原微生物检测，尤其涉及一种检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的引物对和探针组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、动物q热是由贝氏柯克斯体(coxiella burnetii)引起的一种自然疫源性人兽共患病。贝氏柯克斯体可通过气溶胶广泛感染人以及反刍动物、鸟类和节肢动物等。迄今为止，动物q热已成为全球分布最广泛的人兽共患病之一。

2、流产衣原体病是由流产衣原体(chlamydophila abortus)引起的一种人兽共患病。流产衣原体能够造成反刍动物(如绵羊、山羊、牛、猪等)的地方性流产，也可以感染孕妇，造成孕妇流产或罹患其他疾病。动物感染流产衣原体病早期通常不会表现出典型临床症状，因此常常被忽视，从而导致患病动物在妊娠后期出现流产、死胎和产弱仔等现象，造成严重经济损失。

3、布鲁氏菌病又称波浪热、地中海热、马耳他热，是由布鲁氏菌(brucella)引起的一种人兽共患传染病。人感染布鲁氏菌病主要症状有发热、出汗、乏力、关节痛等；动物感染布鲁氏菌病的临床症状是生殖系统受到严重侵害，其中母畜表现为流产、不孕等，公畜表现为睾丸炎、附睾炎等。布鲁氏菌病严重制约了畜牧业可持续发展，直接威胁食品安全和人民生命财产安全。

4、贝氏柯克斯体、流产衣原体和布鲁氏菌都能够在宿主细胞内存活、潜伏感染和免疫逃逸，其所引发的生殖障碍症状相似性很高，在临床上很难区分。就动物q热而言，现有技术缺乏有效的实验室诊断鉴定技术和流行病学资料验证，误诊漏诊现象严重；就流产衣原体病而言，当前流行病学调查大多使用间接血凝试验，缺乏有效的病原学检测方法，致使检测结果偏差较大；就布鲁氏菌病而言，目前没有特殊的唯一性示病临床症状，因此仅依据临床症状很难将其与其他病原微生物感染造成的疾病进行区分。现有技术中也并没有关于动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的检测方法的集成研究，当动物出现流产时，很难快速鉴定病因。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的引物对和探针组、试剂盒及其应用，以解决现有技术中对动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的检测结果偏差大、有效性低、病因确定困难、误诊漏诊现象严重等问题，并且填补了现有技术中同时检测和鉴别我国三种常见的能够引起流产的动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的技术空白。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的引物对和探针组，所述引物对和探针组包括：动物q热检测正向引物q forward、动物q热检测反向引物qreverse、动物q热检测探针qprobe、流产衣原体病检测正向引物ab forward、流产衣原体病检测反向引物ab reverse、流产衣原体病检测探针ab probe、布鲁氏菌病检测正向引物brforward、布鲁氏菌病检测反向引物brreverse和布鲁氏菌病检测探针brprobe；

4、所述动物q热检测正向引物q forward的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述动物q热检测反向引物q reverse的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述动物q热检测探针qprobe的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述流产衣原体病检测正向引物ab forward的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述流产衣原体病检测反向引物ab reverse的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述流产衣原体病检测探针ab probe的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述布鲁氏菌病检测正向引物br forward的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述布鲁氏菌病检测反向引物br reverse的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述布鲁氏菌病检测探针brprobe的核苷酸序列如seq id no.10所示。

5、优选的，所述动物q热检测探针q probe的5’端标记fam，所述流产衣原体病检测探针ab probe的5’端标记vic，所述布鲁氏菌病检测探针br probe的5’端标记cy5，所述动物q热检测探针q probe、流产衣原体病检测探针ab probe、布鲁氏菌病检测探针brprobe的3’端标记mgb。

6、本发明还提供了一种所述的引物对和探针组在制备检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的产品中的应用。

7、本发明还提供了一种检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的试剂盒，包括所述的引物对和探针组。

8、优选的，所述试剂盒的检测方法为三重荧光pcr检测。

9、优选的，所述试剂盒中动物q热检测正向引物q forward、动物q热检测反向引物qreverse、动物q热检测探针qprobe、流产衣原体病检测正向引物ab forward、流产衣原体病检测反向引物ab reverse、流产衣原体病检测探针ab probe、布鲁氏菌病检测正向引物brforward、布鲁氏菌病检测反向引物br reverse、布鲁氏菌病检测探针br probe的浓度独立为5～15μmol/l。

10、本发明还提供了所述的试剂盒在非诊断或治疗目的的检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病中的应用。

11、本发明具有如下技术效果和优点：

12、(1)灵敏度高：对贝氏柯克斯体核酸、流产衣原体核酸和布鲁氏菌核酸的最低检出限可达10.3copies/μl。

13、(2)特异性强：能够特异性针对贝氏柯克斯体、流产衣原体和布鲁氏菌基因组产生相应的荧光扩增信号。经验证，对牛结核分枝杆菌、土拉弗朗西斯菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等相关反刍动物疫病细菌和来自健康动物的组织、血液等核酸样品均无交叉反应。

14、(3)快速高通量：检测速度快，加入核酸样品后1h内即可完成整个taqman mgb三重荧光pcr检测过程，能够同时实现贝氏柯克斯体、流产衣原体和布鲁氏菌的检测鉴别以及多达96～384个核酸样品的同步检测。

15、(4)操作简便：仅使用荧光定量pcr仪即可完成全部taqmanmgb三重荧光pcr检测以及结果判定，不需要借助琼脂糖凝胶电泳等其他技术手段辅助鉴定。同时，所用引物对和探针组基于序列位点差异优化设计，检测背景值低，更易于判定检测结果。

技术特征：

1.一种检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的引物对和探针组，其特征在于，所述引物对和探针组包括：动物q热检测正向引物q forward、动物q热检测反向引物qreverse、动物q热检测探针qprobe、流产衣原体病检测正向引物ab forward、流产衣原体病检测反向引物ab reverse、流产衣原体病检测探针ab probe、布鲁氏菌病检测正向引物brforward、布鲁氏菌病检测反向引物brreverse和布鲁氏菌病检测探针brprobe；

2.根据权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述动物q热检测探针q probe的5’端标记fam，所述流产衣原体病检测探针ab probe的5’端标记vic，所述布鲁氏菌病检测探针brprobe的5’端标记cy5，所述动物q热检测探针q probe、流产衣原体病检测探针abprobe、布鲁氏菌病检测探针brprobe的3’端标记mgb。

3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的产品中的应用。

4.一种检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物对和探针组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测方法为三重荧光pcr检测。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中动物q热检测正向引物qforward、动物q热检测反向引物q reverse、动物q热检测探针q probe、流产衣原体病检测正向引物ab forward、流产衣原体病检测反向引物ab reverse、流产衣原体病检测探针abprobe、布鲁氏菌病检测正向引物br forward、布鲁氏菌病检测反向引物brreverse、布鲁氏菌病检测探针brprobe的浓度独立为5～15μmol/l。

7.权利要求4～6任一项所述的试剂盒在非诊断或治疗目的的检测动物q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病中的应用。

技术总结
本发明涉及一种检测动物Q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病的引物对和探针组、试剂盒及其应用，属于病原微生物检测技术领域。本发明的引物对和探针组、试剂盒采用三重荧光PCR检测，能够同时检测和鉴别引起流产的动物Q热、流产衣原体病和布鲁氏菌病，具有准确率高、灵敏度高、特异性强、快速高通量、操作简便等优点。

技术研发人员：孙翔翔,孙明军,刘蒙达,张皓博,樊晓旭,孙淑芳,焉鑫,张培培,张研博,南文龙,邵卫星,田莉莉,亓菲,孙世雄,王毓秀
受保护的技术使用者：中国动物卫生与流行病学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15