一种用于膀胱癌精准治疗的双靶向基因线路的制作方法

本发明涉及人工基因应用，具体涉及一种用于膀胱癌精准治疗的双靶向基因线路。

背景技术：

1、膀胱癌(bc)是泌尿系统内一种高度侵袭性且复杂的恶性肿瘤。尽管存在多种治疗选择，包括化疗、放疗和基因治疗，但这些治疗的相关副作用和有限疗效在bc的管理中提出了重大挑战。肿瘤生物标志物的筛查是癌症诊断、治疗和预后评估的重要步骤。生物信息学的快速发展和广泛应用为肿瘤生物标志物的筛查提供了有力支持。生物信息学使研究人员能够分析大量生物数据，以识别传统研究方法可能无法明显显示的模式和相关性。通过将生物信息学技术应用于膀胱癌研究，我们可以更深入地了解这种疾病的分子机制。

2、合成生物学利用基因工程、系统生物学和计算机工程等学科的工具，根据特定需求设计甚至创建生物系统。2000年，science报道了合成两个人工基因网络——振荡器和开关，正式开启了合成生物学研究中被称为基因线路的重要分支。基因线路中常见的调控模式类似于电子元件中的“开关”和“逻辑门”。"开关"是能够执行特定识别功能的分子结构，例如核糖开关和rna开关。布尔逻辑门是基因线路设计的核心，可以执行布尔逻辑函数(非、与、或)。"与"门是一种基本的数字逻辑门，可以集成多个输入信号，并且仅在所有输入信号存在时输出信号。例如，kemmer等人设计了一个基因线路，使用"与"门在体内调节尿酸平衡。该基因线路可以通过在高尿酸刺激条件下表达尿酸氧化酶来降低尿酸水平。进一步的实验表明，当将基因线路装置植入具有尿酸氧化酶缺乏的转基因小鼠中时，尿酸水平显著降低，肾脏中的尿酸晶体沉积也显著减少。谢等人构建了一个多输入rnai基于逻辑线路，用于识别特定的hela癌细胞。合成生物学是一门新兴的领域，它利用工程方法和基因组知识来设计、构建和优化新颖的生物系统，在医学领域得到了广泛应用。合成生物学中最常用的工具之一是crispr/cas9系统，它可以精确编辑dna序列。然而，传统形式的cas9蛋白受限于双链dna断裂，从而限制了其在基因调控中的应用。为了克服这个限制，发展了一种名为cas9核酸酶失活突变体(dcas9)的变异体。dcas9缺乏cas9的催化活性，但仍然可以与rna结合并与dna形成稳定的复合物。因此，可以通过使用rna引导靶向特定的dna序列来使用dcas9进行基因表达调控。在dcas9的基因调控应用中，通常使用cas9蛋白结合的rna作为引导rna(grna)，将dcas9定向到特定的dna序列。通过将dcas9与功能单元(转录激活因子或抑制因子)结合，可以实现基因的激活或抑制。使用crispr-dcas9基因编辑工具精确调控基因表达方便、易于操作且高效。

3、人工基因线路是由多个基因组成的系统，可以设计为可控的信号转导网络。通过调控细胞的内部信号转导，人工基因线路可以实现对肿瘤细胞的精确杀伤，从而提高治疗效果。信号转导网络可以被视为一个“开关”，人工基因线路通常是使用逻辑门来控制基因表达的构建。常见的逻辑门包括and门、or门和not门，分别对应于逻辑操作中的“与”、“或”和“非”关系。人工基因线路通常由信号传感器、转录因子、效应基因和反馈环路组成。尽管大多数基因线路的工程原理都已经确立，但它们只能受到单个或少数外源小分子诱导剂、内源rna分子或细胞表面抗原作为“触发因子”的诱导，以控制基因调控。目前我们比较缺乏对膀胱癌相关通路信号网络的整体识别和控制，然而信号转导分子在癌症发展过程中不是独立作用的，而是通过相互作用形成网络。多种基因线路，包括and门，可以感知和处理各种内源信号，已用于癌症识别和治疗。例如，nissim等人合成了一种rna感应的and门线路，仅在两个合成的癌特异性启动子活跃时生成组合的免疫调节输出。chung等人利用模块化合成蛋白构建了一个高效的合成通路，用于重编程癌症信号以实现治疗效果释放。尽管基因线路构建中的模块组合技术已经被广泛应用，但许多以前的研究仅报告了信号通路中少数几个目标分子的调节，缺乏基于信号网络的定向识别和调控。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种用于膀胱癌精准治疗的双靶向基因线路，我们称为逻辑“与”门双靶向基因线路(lag-dtgc)。该线路在靶向细胞中建立逻辑“与”门，利用肿瘤特异性分子作为识别信号。通过重新编程细胞内的致癌信号通路，我们可以控制凋亡相关基因的表达，从而在不影响正常细胞的情况下对膀胱癌细胞进行特定干预。这种创新的癌症治疗方法体现了统一、有针对性策略的潜力。lag-dtgc在癌症治疗中提供了增强的特异性和有效性，因为它靶向癌症进展中涉及的特定分子机制，同时不伤害正常细胞。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种用于膀胱癌精准治疗的双靶向基因线路，包括a基因线路和b基因线路，所述a基因如线路seq id no:1所示，其结构为：监测tgf-β/smad通路活性的人工启动子-dcas9-vpr，所述监测tgf-β/smad通路活性的人工启动子如seq id no:2所示；所述b基因如seq idno:3所示，其结构为监测mapk/erk通路活性的人工启动子-核酶-bax-核酶，所述监测mapk/erk通路活性的人工启动子如seq id no:4所示。

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112、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及益效果：

113、本发明基于合成生物学工程和生物信息学方法的概念，构建了一个带有双靶识别“与”门的基因线路lag-dtgc，被设计用于精确识别和杀灭膀胱癌细胞，而不影响正常细胞。为了测试这些潜在的膀胱癌靶点的特异性，我们选择了两个靶点(cntn1和col14a1)进行验证。cntn1是一种细胞表面神经粘附蛋白，在神经形态和突触形成的发展中起着关键作用。研究表明，cntn1在肿瘤细胞中的表达与乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌等多种肿瘤的恶性程度和预后密切相关。col14a1是一种在细胞外基质中起支持结构和细胞粘附作用的胶原蛋白。研究表明，col14a1的表达水平在乳腺癌、结肠癌、肺癌和肝癌等各种肿瘤中显著升高，并与肿瘤的浸润性和预后密切相关。此外，col14a1还参与调节多个信号通路，如tgf-β、wnt和nf-κb通路。通过双荧光素酶报告基因实验，我们发现cntn1与潜在的下游通路tgf-β/smad存在负调控关系，而col14a1与潜在的下游通路mapk/erk存在负调控关系。这为构建能够识别肿瘤特异性分子作为识别信号的lag-dtgc奠定了基础，通过重新编程细胞的致癌信号通路，实现特异性干预膀胱癌细胞，而不影响正常细胞。lag-dtgc的成功构建突显了合成生物学在癌症治疗中的潜力。通过进一步的优化和测试，这种方法可能会引导出比传统疗法更精确、更有效、更少毒性的新一代癌症治疗方法。这种新范式不仅为癌症治疗提供了有前途的方法，还为生物医学研究领域的跨学科合作潜力提供了启示。