一种稳定表达TRPV4的细胞系及其构建方法与应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种稳定表达trpv4的细胞系及其构建方法与应用。

背景技术：

1、瞬时受体电位香草样蛋白4(transient receptor potential vanilloid 4,trpv4)最早发表于2000年(wissenbach u,bdding m,freichel m,flockerzi v:trp12,anovel trp related protein from kidney.febs letters 2000,485.)。研究表明，trpv4作为物理和化学传感器，主要表达于中枢和外周神经系统，肾脏，内耳，内皮组织和皮肤等各类细胞的质膜上；可以被物理刺激(细胞肿胀，热，机械刺激)和化学刺激(内源性大麻素，花生四烯酸，4α-膦酸酯)激活(clapham d e:trp channels as cellular sensors.nature2003 426:517-524)。trpv4是一种非选择性阳离子通道，对ca2+的渗透性远高于其他阳离子(如na+、k+、cs+和li+)，因此可以将其作为ca2+介导细胞信号转导的触发器，引起下游级联反应，在各器官和系统中发挥重要生理功能(liedtke w,friedman j m:abnormal osmoticregulation in trpv4-/-mice.proceedings of the national academy of sciences2003,100:13698-13703)。有研究报道trpv4参与渗透调节(liedtke w,choe y,martí-renom ma,bell am,denis cs,hudspeth aj,friedman jm,heller s:vanilloidreceptor-related osmotically activated channel(vr-oac),a candidate vertebrateosmoreceptor.cell 2000,103:525-535.)、内皮屏障(tam,t.,t.,phuong,sarah,n.,redmon,oleg,yarishki,jacob:calciuminflux through trpv4 channels modulates theadherens contacts between retinal microvascular endothelial cells.journal ofphysiology 2017.),(pairet n,mang s,fois g,keck m,m.k,gindele j,frick m,dietlp,lamb dj,bernhard r:trpv4 inhibition attenuates stretch-induced inflammatorycellular responses and lung barrier dysfunction during mechanicalventilation.plos one 2018,13:e0196055.)、血管张力(nelson mt,bonev ad,dalsgaardt,santana lf,scott j,kotlikoff mi,sonkusare sk:elementary ca2+signals throughendothelial trpv4 channels regulate vascular function.bmc pharmacology andtoxicology 2013,14.)、痛觉(kanju p,chen y,lee w,yeo m,lee sh,romac j,shahid r,fan p,gooden dm,simon sa:small moleculedual-inhibitors of trpv4 and trpa1 forattenuation of inflammation and pain.scientific reports 2016,6:26894.)、骨稳态(masuyama r,vriens j,voets t,karashima y,owsianik g,vennekens r,lieben l,torrekens s,moermans k,an vb:trpv4-mediated calcium influx regulates terminaldifferentiation of osteoclasts.cell metabolism 2008,8:257-265.)、肺部(morganjts,wade g.mckee,robert a.gleghorn,jason p.:the mechanosensitive ion channeltrpv4 is a regulator oflung development and pulmonary vasculaturestabilization.cellular and molecular bioengineering 2018,11.)和肾功能(liedtkew,friedman jm:abnormal osmotic regulation in trpv4-/-mice.proceedings of thenational academy of sciences 2003,100:13698-13703.)的完整性，以及瘙痒等过程(michael c,pang z:trp channels in skin biology andpathophysiology.pharmaceuticals 2016,9:77.)，但其具体作用机制尚未完全阐明；当其功能障碍时往往会导致相关的疾病发生，然而，目前针对trpv4的内源性激动剂发现的较少，现有激动剂/拮抗剂多是设计合成，这对于该蛋白的功能研究及其药物开发也造成了困扰。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

2、为此，本发明第一方面提供一种稳定表达trpv4的细胞系，所述细胞系的保藏编号为cgmcc no.45608。

3、本发明第二方面提供一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包括trpv4基因的表达盒。

4、根据本发明的具体实施方案，所述慢病毒载体选自pslenti、plenti、pclenti、plvx中的至少其中之一。

5、根据本发明的具体实施方案，所述慢病毒载体为pslenti-sfh-egfp-p2a-puro-cmv-trpv4-3xflag-wpre载体。

6、本发明第三方面提供一种重组慢病毒载体系统，所述重组慢病毒载体系统包括上述的重组慢病毒载体和慢病毒包装载体、慢病毒包膜蛋白表达载体。

7、本发明第四方面提供一种构建稳定表达trpv4的细胞系的方法，所述方法包括：

8、(1)对上述的重组慢病毒载体进行慢病毒包装，所述慢病毒中含有表达trpv4蛋白的核酸序列，

9、(2)将所述慢病毒转染受体细胞，获得稳定表达trpv4的细胞系。

10、根据本发明的具体实施方案，所述受体细胞包括源自灵长目细胞、鼠源细胞中的任意一种。

11、根据本发明的具体实施方案，所述受体细胞为人源细胞，所述人源细胞包括选自hek-293细胞、hela细胞、nci-60细胞中的任意一种。

12、根据本发明的具体实施方案，所述hek-293细胞包括选自hek-293t细胞、hek-293ft细胞中的至少一种。

13、本发明第五方面提供上述的稳定表达trpv4的细胞系、重组慢病毒载体、重组慢病毒载体系统在开发和筛选trpv4干预药物、探索trpv4功能中的用途。

14、本发明第六方面提供一种trpv4激动剂的筛选方法，所述方法包括：

15、将待测试剂与上述的稳定表达trpv4的细胞系或者上述的方法构建的稳定表达trpv4的细胞系接触，将接触前后ca2+内流增强作为待测试剂为trpv4激动剂的指示。

16、本发明第七方面提供一种trpv4抑制剂或拮抗剂的筛选方法，所述方法包括：

17、将待测试剂与上述的稳定表达trpv4的细胞系或者上述的方法构建的稳定表达trpv4的细胞系接触，将接触前后ca2+内流降低作为待测试剂为trpv4抑制剂或拮抗剂的指示。

18、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

19、保藏信息：

20、菌株名称：trpv4-hek293t

21、分类名：稳定表达小鼠trpv4基因的hek293t细胞株

22、保藏日期：2023年5月10日

23、保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)

24、保藏编号：cgmcc no.45608