一种提高大豆种子血红蛋白表达量的方法与流程

(一)本发明涉及一种利用种子特异性启动子提高大豆种子血红蛋白表达量的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、血红蛋白/肌红蛋白是常见的血红蛋白，包括动物血红蛋白、肌红蛋白以及植物血红蛋白。随着植物肉行业的兴起，作为植物肉中一种重要的着色、风味添加剂，血红蛋白/肌红蛋白的需求越来越大。规模化、低成本生产血红蛋白/肌红蛋白的方法是现实生产中所急需的。微生物发酵法是当前血红蛋白的主要生产方式，这种方法存在产量低，生产成本高、提取纯化难度大、容易污染等多个缺点。

2、转基因植物已成为一种有吸引力的重组蛋白表达系统。由于蛋白含量高、蛋白酶活性低、水分含量低、方便运输和储存等，种子成为表达重组蛋白的理想器官之一。现在已经有多种在大豆种子中生产豆血红蛋白的方法和技术，比如，中国专利申请2022100500952，提供了一种在大豆种子中生产豆血红蛋白的技术，血红蛋白/肌红蛋白表达量可以达到种子干重的0.1％；中国专利申请202180073425.3，通过定点插入技术修饰大豆基因组，可将大豆种子中豆血红蛋白含量提高到总蛋白含量的0.5％，接近种子干重的0.25％。

3、表达量低是豆血红蛋白生产迫切需要解决的问题，也是导致豆血红蛋白成本高，影响在生产中广泛应用的主要原因，提高血红蛋白含量是降低成本最有效的方式。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种提高大豆种子血红蛋白表达量的方法，通过选择种子特异性启动子，优化表达元件和表达框组合，大幅度提高大豆种子中豆血红蛋白的表达量，为血红蛋白的生产提供了更经济的技术方案。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种提高大豆种子血红蛋白表达量的方法，所述方法是将含血红蛋白表达框的表达载体转入大豆中，获得高效表达血红蛋白的转基因大豆，大幅度提高大豆种子中血红蛋白的表达量；所述血红蛋白表达框包括种子特异性启动子、血红蛋白、终止子和调控序列；所述种子特异性启动子为大豆7s球蛋白启动子pcg1，核苷酸序列为seq id no:1所示，所述调控序列为烟草rb7核基质结合区调控序列mar，核苷酸序列seq id no:2所示。

4、进一步的，所述血红蛋白表达框的元件组成为：种子特异性启动子、血红蛋白、终止子、调控序列。

5、进一步的，所述血红蛋白为大豆血红蛋白lgh(氨基酸序列seq id no:3)。根据大豆密码子偏好性合成相应的核苷酸序列，核苷酸序列如seq id no:4所示。

6、进一步的，所述血红蛋白表达框的终止子为nos终止子tnos，核苷酸序列为seq idno:5所示。

7、进一步的，所述表达载体还包括筛选基因表达框，所述筛选基因为耐草甘膦基因g10evo epsps(核苷酸序列seq id no:9)，所述筛选基因表达框元件组成：花椰菜花叶病毒35s启动子pcamv35s(核苷酸序列seq id no:6)，osepsps sp信号肽序列(核苷酸序列seqid no:7)，耐草甘膦基因g10evo epsps(核苷酸序列seq id no:9)，花椰菜花叶病毒35s终止子tcamv35s(核苷酸序列seq id no:8)。

8、进一步的，所述表达载体包含2个串联的血红蛋白表达框和1个筛选基因表达框。

9、本发明还提供一种包含所述表达载体的大豆细胞。

10、本发明提供一种由含所述表达载体的转基因大豆制成的食品添加剂或大豆副产品。

11、本发明还提供一种由所述方法生产的血红蛋白制作的食品添加剂，所述食品添加剂包括着色添加剂、风味调节剂。

12、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

13、1、本发明利用种子特异性启动子在大豆中表达血红蛋白，有效提高其表达量，比常规组成型启动子表达量提高95％。

14、2、本发明通过在大豆中导入两个串联的血红蛋白表达框，与单个血红蛋白种子特异性表达框相比有效提高其表达量将近75％，比常规组成型启动子表达量提高238％。

15、3、利用本发明的方法生产的血红蛋白可以作为食品的着色添加剂、风味调节剂，且极大的降低了生产成本，是一种更加环境友好型的生产方式。

16、4、利用本发明的方法获得的高效表达血红蛋白转基因大豆，可直接作为产品原料，制作成富含血红蛋白的大豆副产品。

技术特征：

1.一种提高大豆种子血红蛋白表达量的方法，其特征在于，所述方法是将含血红蛋白表达框的表达载体转入大豆中，获得高效表达血红蛋白的转基因大豆，大幅度提高大豆种子中血红蛋白的表达量；所述血红蛋白表达框包括种子特异性启动子、血红蛋白、终止子和调控序列；所述种子特异性启动子为大豆7s球蛋白启动子pcg1，核苷酸序列为seq id no:1所示，所述调控序列为烟草rb7核基质结合区调控序列mar，核苷酸序列seq id no:2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白表达框的元件组成为：种子特异性启动子、血红蛋白、终止子、调控序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，血红蛋白的编码基因核苷酸序列如seq idno:4所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红蛋白表达框的终止子为nos终止子tnos，核苷酸序列为seq id no:5所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体还包括筛选基因表达框，所述筛选基因为耐草甘膦基因g10evo epsps，所述筛选基因表达框元件组成：花椰菜花叶病毒35s启动子pcamv35s，osepsps sp信号肽序列，耐草甘膦基因g10evo epsps，花椰菜花叶病毒35s终止子tcamv35s；osepsps sp信号肽的核苷酸序列为seq id no:7所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体包含2个串联的血红蛋白表达框和1个筛选基因表达框。

7.一种包含权利要求1所述表达载体的大豆细胞。

8.一种由含权利要求1所述表达载体的转基因大豆制成的食品添加剂或大豆副产品。

9.一种由权利要求1所述方法生产的血红蛋白制作的食品添加剂。

10.如权利要求9所述的食品添加剂，其特征在于，所述食品添加剂包括着色添加剂、风味调节剂。

技术总结
本发明公开了一种提高大豆种子血红蛋白表达量的方法，所述方法是将含血红蛋白表达框的表达载体转入大豆中，获得高效表达血红蛋白的转基因大豆，大幅度提高大豆种子中血红蛋白的表达量。本发明利用种子特异性启动子在大豆中表达血红蛋白，与常规普通组成型启动子相比表达量提高95％。通过在大豆中导入两个串联的血红蛋白表达框，与单个种子特异性血红蛋白表达框相比有效提高其表达量将近75％。利用本发明的方法生产的血红蛋白可以作为食品的着色添加剂、风味调节剂，且极大的降低了生产成本，是一种更加环境友好型的生产方式。利用本发明的方法获得的高效表达血红蛋白转基因大豆，可直接作为产品原料，制作成富含血红蛋白的大豆副产品。

技术研发人员：林海燕,赵宇,张青,于小星,林朝阳
受保护的技术使用者：安徽美瑞生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15