一种利用甲藻高效低碳生产PerCP的方法

本发明属于生物技术的工业化领域，具体涉及一种利用赤潮甲藻高效低碳生产percp的方法。

背景技术：

1、微藻是重要的海洋生物资源，大自然中存在着不同种类的微藻，如蓝藻、红藻、硅藻和甲藻等等。大自然的演变赋予了每种藻不同的生产价值。有文献和专利报道蓝藻、红藻和硅藻分别适合生产藻蓝蛋白、藻红蛋白和岩藻黄素，而甲藻则是生产percp的必备藻种。虽然甲藻的无序爆发会造成赤潮现象，危害生态的平衡、渔业的生产，乃至人类的健康，但是甲藻中含有独特的光系统，是percp的唯一来源，此外其还有β-胡萝卜素、硅藻黄素和硅甲藻黄素等色素，以及dha和epa等高价值的多不饱和脂肪酸。因此，利用赤潮甲藻来生产percp不仅可以带来经济利益，同样也是变废为宝，有助于科学的管控赤潮甲藻，为解决环境问题提供思路。

2、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物percp(peridinin-chlorophyll-proteincomplex)是独存于海洋甲藻的一种水溶性捕光复合物，其在荧光标记、金属增强荧光、人工捕光复合物和生物与医药方面具有重大的研究和应用价值。例如某专利(公开号为cn106290812a)讲述了一种b细胞恶性肿瘤相关抗原表达量检测试剂盒及检测方法，将percp标记的抗cd45抗体用于肿瘤检测。也有专利(公开号为cn112098646a)提供了一种定量检测淋巴细胞亚群的试剂盒及其检测方法，将cd45percp-cy5.5用于流式细胞仪检测，测定各个淋巴细胞亚群的百分比。

3、环境因子是影响海洋甲藻生长和percp生产的重要因素。当外部环境改变时，甲藻细胞会产生一系列的变化来适应外部环境，包括影响甲藻细胞的增殖和生长，以及用来传递光能的percp的生产。因此，改变培养基中氮磷比、有机物组分以及光源组成等因素均可显著影响甲藻细胞内percp的生物合成和积累。赤潮甲藻种属众多，氮磷比对其的生长也有学者研究。例如，胡章喜等人研究了东海原甲藻、球形棕囊藻和尖刺拟菱形藻的最适生长氮磷比，发现最适氮磷比分别为30：1、30：1和10：1(氮磷比率对3种典型赤潮藻生长的影响，水生生物学报，2008，(04)：482-487)；葛蔚等人研究发现当氮磷比达到16：1时，强壮前沟藻具有最高的比生长速率和细胞密度(1.5×105cells/ml)(氮磷比对不同生长时期强壮前沟藻富集2,2’,4,4’-四溴联苯醚的影响，水生生物学报，2014，38(05)：841-847)。上述研究表明尽管氮磷比可以影响甲藻的生长，但是它们的比值并不高，也无法促使甲藻达到更高的细胞密度，此外亦没有对percp生产和积累的数据。

4、异佛尔醇在化学工业中具有较好的应用，其是合成环扁桃酸酯的中间体，也是合成新型增塑剂、润滑剂、二腈、二胺和醇的中间体。有研究报道在大麻愈伤组织中发现异佛尔醇会被生物转化为异佛尔酮(biotransformation of cannabinoid precursors andrelated alcohols by suspension cultures of callus induced from cannabissativa l.[j].chemical and pharmaceutical bulletin,1977.pp 1941-1946)。但是，异佛尔醇对赤潮甲藻的生长和percp的高效积累效果和作用机制，以及在甲藻中的应用尚无相关报道。

5、此外，光谱作为重要的环境因素之一，往往对捕光蛋白有较为显著的影响。因此，改变光谱的组分会让甲藻细胞调整percp的含量。有研究表明，在单色光条件下，利玛原甲藻在蓝光中具有比绿光和红光更高的生长速率，可以达到0.0785，而在组合光条件下，利玛原甲藻在蓝绿光中具有最高的生长速率，且比任一单色光下的生长速率要高(光谱对中肋骨条藻和利玛原甲藻生长作用的研究[d].中国海洋大学，2012)。上述研究尽管表明组合光谱可以影响甲藻的生长，但目前其对percp的含量及其积累的影响尚不明确，亦没有研究提及甲藻积累percp所需的最适组合光谱。

6、综上所述，目前仅知道甲藻可以生产percp，却不知道哪个种属的甲藻适合生产percp，也没有相互之间的含量比对数据。此外，目前percp难以积累且含量较低。由于percp具有重大的应有价值，因此目前市场上主要是对于percp的应用的研究，而缺少对于如何高效低碳生产percp的研究。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明提供一种利用甲藻高效低碳生产percp的方法。

2、为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

3、一种利用甲藻高效低碳生产percp的方法，包括如下步骤：

4、(1)将甲藻接种至改良l1培养基中培养，光照培养至对数生长期，得到甲藻的种子液；

5、(2)将甲藻种子液接种至添加有异佛尔醇的改良l1培养基中进行培养；

6、其中，步骤(2)中，所述添加有异佛尔醇的改良l1培养基中异佛尔醇浓度为5～25mg/l，氮磷比为10：1～80：1；光照条件为：白光或者蓝光红光组合光，当为蓝光红光组合光时，蓝光在总光照强度中的比例为40％～70％。

7、需要说明的是，所述氮磷比为氮磷摩尔比。本发明中，通过改变含氮元素物质的浓度调整氮磷比。

8、优选地，步骤(2)中，氮磷比为40：1～80：1；进一步优选为60：1。

9、优选地，异佛尔醇的浓度为10～20mg/l。

10、优选地，步骤(2)中，光照条件为蓝光红光组合光时，蓝光在总光照强度中的比例为50％～70％。

11、优选地，步骤(2)中，培养的光照强度为50-70μmol/m2/s；优选为60μmol/m2/s。

12、优选地，所述甲藻为赤潮甲藻，包括强壮前沟藻、虫黄藻、亚历山大藻、东海原甲藻、极地甲藻、新月梨甲藻、多边舌甲藻、原角藻、异帽藻、裸甲藻、薄甲藻。

13、优选地，步骤(1)中，种子液的培养是将甲藻接种至改良l1培养基中，所述改良l1培养基中，氮磷比为10，不添加异佛尔醇，光照培养至对数生长期(一般7天)，得到甲藻的种子液。

14、优选地，步骤(1)中，所述改良l1培养基组分如下：最终含氮量为0.5mmol/l的蛋白胨；nah2po4·2h2o 7.8mg/l；na2edta·2h2o 4.36mg/l；fecl3·6h2o 3.15mg/l；cuso4·5h2o0.6125μg/l；na2moo4·2h2o 59.7μg/l；znso4·7h2o 0.022mg/l；cocl2·6h2o 0.01mg/l；mncl2·4h2o 0.18mg/l；h2seo3 2.6μg/l；niso4·6h2o 2.7μg/l；na3vo4 1.84μg/l；k2cro41.94μg/l；vitamin b12 0.5μg/l；biotin 0.5μg/l；vitamin b10.1mg/l，使用天然海水配制，使用乙酸调节ph为8.0。

15、优选地，步骤(2)中，培养的时间为10-14天，优选为12天。

16、优选地，所述的培养温度优选为20±1℃。

17、优选地，步骤(2)中，甲藻藻种接种密度为1×105-2×106cells/ml添加计算，优选为1×106cells/ml。

18、本发明的技术方案中，percp含量的测定，包括如下步骤：

19、(1)从培养液中抽取10ml的藻液，5000rpm、5min离心去除上清液，使用配置的海水等渗溶液清洗若干次，再次离心去除上清液；

20、(2)加入10ml的提取缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.1，4℃)，在4℃下进行压力破碎(70mpa)，得到细胞破碎液。

21、(3)接着在4℃下，50000×g离心30min，得到淡红色的上清液。根据其消光系数来推算含量，已知其在最大吸收波长(478nm)处的消光系数为0.406×106cm-1·m-1，摩尔质量为35000g/mol，则可以推算出提取液中percp的含量计算公式为：percp的含量

22、与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：

23、(1)本发明的技术方案提供了一种利用甲藻高效低碳生产percp的方法，通过对培养条件的设计，实现了percp的高效生产。(2)本发明的原料采用赤潮甲藻，有助于科学的管控赤潮甲藻，为解决环境问题提供思路。