柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌

本发明涉及生物，特别涉及柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌。

背景技术：

1、柠檬烯是一种具有重要生理学活性的环状单萜，因其具有令人愉悦的香气、特殊的生物活性(抗癌、抗炎、抗菌、镇咳等)和良好的理化特性(易挥发、低毒性等)而被广泛应用于食品、药品、清洁日化品、化妆品、农药。柠檬烯的脂溶性和较低的冰点使其成为第三代航空燃料的理想候选原料。由于柠檬烯广泛的应用使其全球市场的需求持续增长，预计到2024年，全球市场规模将超过1.9亿美元。

2、目前柠檬烯主要来源是柑橘类(如柠檬、柑橘等)植物提取，存在含量低、培养周期长，产能受限，无法满足当今社会绿色可持续生产的要求。构建高效的异源合成柠檬烯微生物细胞工厂，实现微生物发酵法替换传统的植物提取法，具有重要的经济与社会效益。但是柠檬烯合成酶作为柠檬烯合成途径的关键酶，在微生物体内的催化活性还比较低，目前针对柠檬烯合成酶的改造研究较少。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供的柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌，通过半理性设计的方式对柠檬烯合成酶cltls2进行突变改造，使其具有更高的活性，并在酿酒酵母中进行表达。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了柠檬烯合成酶的突变体，突变位点包括h520f，h520y，h520v，k164a，k164r，e471l，e467a，e466l，r470l，r470f，k474r，l515g或y514l中的一种或两种；

4、所述柠檬烯合成酶的氨基酸序列如seq id no:3所示。

5、在本发明的一些具体实施方案中，上述突变体具有：

6、(1)、如seq id no:4所示的氨基酸序列；或

7、(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

8、(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；

9、所述多个为2个至50个。

10、本发明还提供了核酸分子，具有编码上述突变体的核苷酸序列。

11、在本发明的一些具体实施方案中，上述核酸分子具有：

12、(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或

13、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或

14、(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

15、所述多个为2个至160个。

16、本发明还提供了生产柠檬烯的工程菌，包括上述核酸分子。

17、本发明还提供了合成柠檬烯的工程菌的构建方法，包括将上述核酸分子与ndps1基因构建成表达盒，再将表达盒整合至宿主细胞，完成工程菌构建；

18、所述工程菌包括酿酒酵母；

19、所述酿酒酵母包括酿酒酵母重组菌。

20、本发明还提供了如下任意项在合成柠檬烯中的应用：

21、(a)、上述突变体；(b)、上述核酸分子；(c)、上述工程菌。

22、本发明还提供了合成柠檬烯的方法，基于上述突变体、上述核酸分子或上述工程菌合成或构建。

23、本发明还提供了酶，其具有：

24、所述柠檬烯合成酶突变体包含如下氨基酸突变的一种或两种组合：h520f，h520y，h520v，k164a，k164r，e471l，e467a，e466l，r470l，r470f，k474r，l515g，y514l。

25、突变体h520f代表第520位的组氨酸突变为苯丙氨酸，突变体h520y代表第520位的组氨酸突变为酪氨酸，突变体h520v代表第520位的组氨酸突变为缬氨酸，突变体k164a代表第164位的赖氨酸突变为丙氨酸，突变体k164r代表第164位的赖氨酸突变为精氨酸，突变体e471l代表第471位的谷氨酸突变为亮氨酸，突变体e467a代表第467位的谷氨酸突变为丙氨酸，突变体e466l代表第466位的谷氨酸突变为亮氨酸，突变体r470l代表第470位的精氨酸突变为亮氨酸，突变体r470f代表第470位的精氨酸突变为苯丙氨酸，突变体k474r代表第474位的赖氨酸突变为精氨酸，突变体l515g代表第515位的亮氨酸突变为甘氨酸，突变体y514l代表第514位的酪氨酸突变为亮氨酸。

26、其中，所述柠檬烯合成酶突变体为h520f和e471l的双突变体，双突变体代表第520位的组氨酸突变为苯丙氨酸，同时第471位的谷氨酸突变为亮氨酸。

27、本发明还提供了编码所述的柠檬烯合成酶的突变型基因或核酸。

28、其中，编码所述柠檬烯合成酶的突变型基因或核酸的第1411位核苷酸由g变成t，第1412位核苷酸由a变成t，第1413位核苷酸由a变成g，第1558位核苷酸由c变成a，第1559位核苷酸由a变成t。

29、其中，所述柠檬烯合成酶的突变型基因序列如序列表中seq id no:2所示，其氨基酸序列如序列表中seq id no:4所示。

30、其中，序列表中的seq id no:4的氨基酸序列编码的柠檬烯合成酶命名为cltls2h520f/e471l，所述突变体相对于野生型的氨基酸其第520位的组氨酸突变为苯丙氨酸，同时第471位的谷氨酸突变为亮氨酸。

31、本发明还提供了上述柠檬烯合成酶突变体的获得方法，具体包括：

32、(1)通过文献搜寻与分子对接相结合的方法设计柠檬烯合成酶基因突变体库。

33、(2)在细胞中构建以npp为底物的柠檬烯正交合成途径，具体方法如下：将npp合成酶与柠檬烯合成酶突变体导入到高产ipp与dmapp的酿酒酵母菌株ycs1(acs syntheticbiology,2019,8(5):968-975)中，挑选正确的转化子进行测试，挑选出效果最好的柠檬烯合成酶突变体。

34、本
技术实现要素：
还包括含有所述的柠檬烯合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌。

35、在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株包括酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

36、本发明还包括所述柠檬烯合成酶酿酒酵母多拷贝整合的菌株。

37、本发明的柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌有如下效果：

38、本发明在截短的柑橘来源的柠檬烯合成酶基因cltls2(protein entry:q8l5k1)的基础上，对d-柠檬烯合成酶进行进化改造，获得了催化活力更高的柠檬烯合酶突变体，并将筛选到的柠檬烯合成酶突变体多拷贝整合至酿酒酵母，进一步提高了产量，为其他单萜的微生物合成提供了参考。

技术特征：

1.柠檬烯合成酶的突变体，其特征在于，具有如下突变中的任一种：

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，具有：

3.核酸分子，其特征在于，具有编码如权利要求1或2所述的突变体的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，具有：

5.工程菌，其特征在于，具有如权利要求3或4所述的核酸分子；

6.合成柠檬烯的工程菌的构建方法，其特征在于，包括将如权利要求3或4所述的核酸分子的序列与ndps1基因构建成表达盒，再整合至宿主细胞，完成构建；

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及柠檬烯合成酶突变体及柠檬烯生产工程菌。本发明公开了一种催化活性提高的柠檬烯合成酶突变体，本发明在截短的野生型柠檬烯合成酶CltLS2的基础上通过特定位点的突变(H520F，E471L)，得到柠檬烯合成酶组合突变体，提高了对NPP底物的催化活性。本发明还将所述的柠檬烯合成酶突变体整合至酿酒酵母多拷贝位点，构建生产柠檬烯的工程菌株，应用到柠檬烯的合成之中，也为其他单萜的微生物合成提供了借鉴。

技术研发人员：赵广荣,关蕾蕾,乔建军
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15