基于LAMP检测有青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的引物组合物、试剂盒及方法

本发明属于基因工程领域，涉及基于lamp检测有青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)引起烟草青枯病是危害世界烟草生产的重要病，已成为制约烟叶生产的重要因素。烟草青枯病在田间发病时往往表现为烟草叶片的一侧萎蔫、变黄，发病严重时，可以造成烟草的整株死亡，是烟草生产上破坏最为严重的病害之一。

2、烟草疫霉菌(phytophthora nicotianae)是引起烟草黑胫病的主要病原菌，主要危害烟草的根和茎基部，致使维管束组织坏死，最终导致烟株萎蔫枯死。烟草黑胫病发病率高、危害严重，是困扰烟草生产的主要病害。更为重要的是，烟草疫霉菌产生的病残体可以在烟田土壤中存留若干年，导致黑胫病非常顽固，防控措施效果有限，极大地增加了病原菌检测工作的难度。

3、传统检测青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的方法是可以直接通过肉眼观察病原物的菌组织或子实体等病征，还可以通过染色镜检对于形态特殊的病原体进行直观的检查，或采用组织分离培养法获得病原菌纯培养物，接种发病进行致病性检验，但是这些传统的检测方法费时费力，对于不产孢的病原菌及尚未出现病症的植物，难以做出准确的判断。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于pcr的方法已成功用于检测青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌，虽然基于pcr的检测方法具有特异性强、灵敏度高、功能丰富等特点，并且不需要对病原菌进行分离培养，但是检测时间较长，其检测灵敏度高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

4、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是日本荣研株式会发明的基于pcr反应的分子检测技术，该技术在bstdna聚合酶的作用下发生自循环链置换反应，不需要其它聚合酶繁琐的模板变性等步骤，反应能在恒温条件下完成。整个反应过程在60-65℃进行大约1h，简单的加热装置如水浴锅就可以发生反应，降低反应成本和反应的复杂性。lamp检测技术至少需要四条引物，与靶标dna序列的六个不同区域互补，增加反应特异性。lamp扩增产物可以直接通过加染色剂变色用肉眼观察到，常见的染色剂有hnb、sybr green i和钙黄绿素等，也可以通过琼脂糖凝胶进行分析，根据是否会产生典型的梯状条带判断。这种可视化的lamp技术被应用于不同的植物病原菌的检测，但目前未见用于检测青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供基于lamp检测有青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的引物组合物、试剂盒及方法，克服了现有技术中青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的问题。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种基于lamp检测有青枯雷尔氏菌的引物组合物，所述引物组合物包括六条特异性引物，所述六条特异性引物具体为正向内引物rs-fip、反向内引物rs-bip、正向外引物rs-f3、反向外引物rs-b3、环引物rs-lf和环引物rs-lb；所述正向内引物rs-fip、反向内引物rs-bip、正向外引物rs-f3、反向外引物rs-b3、环引物rs-lf和环引物rs-lb的碱基序列分别如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示。

3、第二方面，本发明提供一种基于lamp检测有青枯雷尔氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的基于lamp检测有青枯雷尔氏菌的引物组合物。

4、在本发明的一些实施例中，基于lamp检测有青枯雷尔氏菌的试剂盒，所述试剂盒包含正向内引物rs-fip和反向内引物rs-bip各1μl、正向外引物rs-f3和反向外引物rs-b3各0.5μl、环引物rs-lf和环引物rs-lb各1μl。

5、第三方面，本发明提供一种基于lamp检测有烟草疫霉菌的引物组合物，所述引物组合物包括六条特异性引物，所述六条特异性引物具体为正向内引物pp-fip、反向内引物pp-bip、正向外引物pp-f3、反向外引物pp-b3、环引物pp-lf和环引物pp-lb；所述正向内引物pp-fip、反向内引物pp-bip、正向外引物pp-f3、反向外引物pp-b3、环引物pp-lf和环引物pp-lb的碱基序列分别如seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq idno:11、seq id no:12所示。

6、第四方面，本发明提供一种基于lamp检测有烟草疫霉菌的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求4所述的引物组合物。

7、在本发明的一些实施例中，本发明所述的基于lamp检测有烟草疫霉菌的试剂盒，所述正向内引物pp-fip和所述反向内引物pp-bip为内引物、所述正向外引物pp-f3和所述反向外引物pp-b3为外引物、所述环引物pp-lf和所述环引物pp-lb为环引物；所述外引物与所述内引物以及所述环引物的浓度比为所述外引物：所述内引物：所述环引物＝0.2：1.6：0.4。

8、在本发明的一些实施例中，本发明提供一种基于lamp检测有青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的试剂盒，所述试剂盒还包括1.5μl 100mmmgso4、3.5μl 10mm为dntp、5μl 5m甜菜碱、1μl 8u/μl bst聚合酶、2μl模板dna、2.5μl10×thermo polbuffer和无菌水补足至25μl。

9、第五方面，本发明提供一种基于lamp检测青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的方法，包括如下步骤：

10、(1)提取待检微生物的dna，以提取的dna为模板，将权利要求1或4所述的lamp引物组合物进行lamp；

11、(2)将步骤(1)的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下进行结果检测；或以sybr green i为指示剂，对步骤(1)所述的lamp的反应体系进行结果检测。

12、在本发明的一些实施例中，基于lamp检测青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的方法，步骤(1)中，以2μl dna为模板，进行lamp；所述进行lamp的溶液为权利要求7所述的试剂盒，所述进行lamp的反应程序为：60℃-65℃，55-90min；步骤(2)中，所述sybr green i为0.2μl。

13、在本发明的一些实施例中，基于lamp检测青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的方法，其特征在于，所述进行lamp的反应程序为：63℃，45min。

14、本发明的有益效果在于：

15、(1)检测更方便、更高效：普通pcr反应容易造成产物扩散、实验室污染，并且依赖热循环仪器，本发明提供的基于lamp检测有青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的方法，其中的lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后加入sybr green i，常光下观察颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在田间的应用价值；

16、(2)灵敏度高：本发明提供的基于lamp检测有青枯雷尔氏菌的方法，利用sybrgreen i建立青枯雷尔氏菌的lamp体系，可以检测到10-6ng/μl的青枯雷尔氏菌，检测灵敏度比普通pcr提高104倍；比kubota等建立的青枯病菌的lamp体系多两条环引物从而缩短了反应时间；

17、(3)灵敏度高：本发明提供的基于lamp检测有烟草疫霉菌的方法，建立烟草疫霉菌的lamp体系，可以检测到10-5ng/μl的烟草疫霉菌，检测灵敏度比普通pcr提高100倍，比多重pcr检测疫霉菌灵敏度提高了1000倍；比以hnb为指示剂建立的烟草疫霉的lamp体系减少孵育环节，减少反应时间，且灵敏度提高了10倍；另外，hnb需现用现配，很容易在反应前就发生颜色变化，且颜色变化不能明显区分，容易产生紫色、深蓝色、天蓝色三种颜色变化，肉眼不易辨别；而本发明提供的基于lamp检测有烟草疫霉菌的方法，使用的sybr green i颜色变化明显，可在常光下观察颜色变化，判断检测结果，阴性为橙色，阳性为黄绿色且发荧光。

18、(4)特异性强：本发明提供的基于lamp检测有青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的引物组合物，是根据青枯雷尔氏菌的rsflic基因序列和烟草疫霉菌特有的半胱氨酸蛋白酶基因ppcys45序列，并对rsflic基因和ppcys45基因的序列进行比对分析；利用在线应用软件primer explorev5各自设计特异性引物，根据引物长度和引物gc含量等指标筛选引物，lamp反应通过6条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，因此相对于pcr引物只对靶序列的2个不同区域进行识别扩增而言，青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的lamp检测特异性大大提高，检测的准确性大大提高。

19、(5)基于lamp检测青枯雷尔氏菌或烟草疫霉菌的方法，克服了现有技术中青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的问题；所述的方法在45min，63℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌，不需要复杂仪器，能较好满足对青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的田间检疫，为检疫性病害青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的检测提供了新的技术平台，同时也可用于田间青枯雷尔氏菌和烟草疫霉菌的早期诊断和病菌的检测。