孤雌生殖单倍体诱导基因NtDMP及其应用

本发明涉及以基因组编辑技术为主的农业生物和作物遗传育种领域，具体涉及一种植物母本单倍体诱导系的制备方法及其应用，特别涉及一种利用基因编辑技术得到的孤雌生殖单倍体诱导基因ntdmp突变体作为植物单倍体诱导系在诱导植物产生母本单倍体中的应用。

背景技术：

1、大田作物生产是维持人类生存的重要物质基础，在植物学上可以分为单子叶作物和双子叶作物两大类，单子叶作物主要包括水稻、小麦和玉米等，双子叶主要包括大豆、油菜、棉花及番茄、黄瓜等作物。无论是对于单子叶作物还是双子叶作物，纯系创制均是其育种过程的关键环节。单倍体育种技术可加速纯系选育进程，且与基因编辑技术结合可实现对自交系的快速定向改良，能够极大地提高育种效率，是作物育种中的共性关键技术。目前，单倍体育种技术已在玉米育种中得到了大规模应用，且控制玉米单倍体诱导的关键基因已被克隆，这为以杂交诱导为基础的单倍体育种技术体系在其他作物中的构建提供了可鉴路径。目前，磷脂酶基因zmpla1已在水稻、小麦上成功获得了单倍体。但该基因仅在单子叶作物中具有较高保守性，由此在双子叶作物上的应用存在一定限制。

2、目前，在双子叶作物上单倍体的产生主要依靠的还是花药离体培养，效率低下且对材料的基因型依赖性较高，很难实现规模化的应用。虽然将遗传修饰的着丝粒特异组蛋白cenh3导入拟南芥cenh3突变体中可诱导单倍体的产生，但该方式在诱导过程中产生大量的整倍体，这在一定程度上限制了该方法在育种中的应用。

技术实现思路

1、本发明首先提供了b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质的新用途；

2、b1)氨基酸序列是序列2或序列4或序列6或序列8或序列10或序列12或序列14或序列16或序列18所示的蛋白质；

3、b2)在序列2或序列4或序列6或序列8或序列10或序列12或序列14或序列16或序列18所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

4、b3)将序列2或序列4或序列6或序列8或序列10或序列12或序列14或序列16或序列18所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

5、b4)与序列2或序列4或序列6或序列8或序列10或序列12或序列14或序列16或序列18所示的氨基酸序列具有75％或75％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

6、本发明提供了b1)或b2)或b3)或b4)所示的蛋白质在调控植物单倍体诱导能力或果实数目中的应用。

7、所述调控植物单倍体诱导能力体现为：当植物中的上述蛋白质活性被抑制时，所述植物变成植物单倍体诱导系，当植物中的上述蛋白质被表达或活性提高时，所述植物单倍体诱导能力降低或缺失。所述蛋白质活性被抑制为不表达该蛋白质或该蛋白质没有活性。所述植物单倍体诱导能力降低或缺失具体体现为所述植物果实(如角果)数目增加。

8、所述调控植物果实数目体现为：当植物中的上述蛋白质活性被抑制时，所述植物果实(如角果)数目减少，当植物中的上述蛋白质被表达或活性提高时，所述植物果实(如角果)数目增加。所述蛋白质活性被抑制为不表达该蛋白质或该蛋白质没有活性。

9、上述b2)中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

10、上述b3)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

11、上述b4)中，所述75％或75％以上同源性，可为80％以上或85％以上或90％以上或91％以上或92％以上或93％以上或94％以上或95％以上或96％以上或97％以上或98％以上或99％以上的同源性。

12、本发明又提供了与上述蛋白质相关的生物材料的新用途；

13、所述生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：

14、a1)编码上述蛋白质的核酸分子；

15、a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；

16、a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；

17、a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；

18、a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；

19、a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；

20、a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；

21、a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；

22、a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

23、a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

24、a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

25、a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

26、本发明提供了与上述蛋白质相关的生物材料在调控植物单倍体诱导能力或果实数目中的应用。

27、上述a1)中，所述核酸分子为如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的基因：

28、c1)序列1或序列3或序列5或序列7或序列9或序列11或序列13或序列15第33-767位或序列17第32-434位所示的cdna分子或基因组dna分子；

29、c2)与c1)限定的核苷酸序列具有70％或70％以上同一性的cdna分子或基因组dna分子；

30、c3)来源于双子叶植物且与c1)限定的核苷酸序列具有70％或70％以上同一性的cdna分子或基因组dna分子；

31、c4)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交的cdna分子或基因组dna分子。

32、上述基因具有如下功能：当植物中的上述基因被抑制或敲除时，所述植物变成植物单倍体诱导系；当植物中的上述基因被表达时，所述植物的单倍体诱导能力下降，果实数目增加。所述抑制为完全抑制。

33、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或序列4或序列6或序列8或序列10或序列12或序列14或序列16或序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

34、本发明还提供了m1或m2所示的物质的新用途：

35、m1、抑制植物中上述蛋白质活性的物质；

36、m2、抑制植物中编码上述蛋白质的基因表达的物质或敲除植物中编码上述蛋白质的基因的物质。

37、本发明提供了m1或m2所示的物质在培育植物单倍体诱导系或培育植物单倍体或提高植物单倍体诱导能力中的应用。

38、上述应用中，所述抑制植物中上述蛋白质活性的物质可为任何能够使植物中上述蛋白质活性缺失的物质，如抑制上述蛋白质合成或促进上述蛋白质降解或抑制上述蛋白质功能的蛋白质、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制剂)；

39、所述抑制植物中编码上述蛋白质的基因表达的物质可为任何能够使植物中编码上述蛋白质的基因无法表达的物质，如沉默植物中编码上述蛋白质的基因的物质(如mirna、sirna、dsrna、shrna等)；

40、所述敲除意味着携带敲除物质的宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物，敲除物质可以是以任何方式实现宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分(例如启动子编辑)使得编码基因序列不被转录、通过与mrna的结合阻止翻译等。通常，敲除在基因组dna水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。进一步的，所述敲除植物中编码上述蛋白质的基因的物质可为任何能够使植物中编码上述蛋白质的基因发生突变(所述突变形式可为缺失突变和/或插入突变和/或碱基替换)从而失去活性的物质，如锌指蛋白zfn基因编辑系统或talens基因编辑系统或crispr/cas9基因编辑系统等。更进一步的，所述敲除植物中编码上述蛋白质的基因的物质为crispr/cas9基因编辑系统。

41、本发明还提供了一种植物单倍体诱导系的制备方法。

42、本发明提供的植物单倍体诱导系的制备方法为如下d1)或d2)：

43、d1)抑制受体植物中上述蛋白质的活性，得到植物单倍体诱导系；

44、d2)抑制受体植物中编码上述蛋白质的基因的表达或敲除受体植物中编码上述蛋白质的基因，得到植物单倍体诱导系。

45、本发明还提供了一种植物单倍体诱导系的制备方法。

46、本发明提供的植物单倍体诱导系的制备方法包括将按照上述植物单倍体诱导系制备方法制备得到的植物单倍体诱导系进行自交的步骤。

47、本发明还提供了一种提高植物单倍体诱导能力的方法。

48、本发明提供的提高植物单倍体诱导能力的方法包括如下步骤：抑制受体植物中上述蛋白质的活性，或抑制受体植物中编码上述蛋白质的基因的表达，或敲除受体植物中编码上述蛋白质的基因，得到植物单倍体诱导系；所述植物单倍体诱导系的单倍体诱导能力高于所述受体植物。

49、上述植物单倍体诱导系的制备方法中，所述自交的次数至少为一次，具体可为一次。

50、上述植物单倍体诱导系的制备方法还包括筛选纯合突变体的步骤。所述纯合突变体为编码上述蛋白质的基因的两条同源染色体发生了相同突变的植物个体。

51、进一步的，当所述受体植物为油菜时，所述基因为bndmp1a基因和/或bndmp2a基因和/或bndmp1c基因和/或bndmp2c基因；所述方法为抑制油菜中bndmp1a基因和/或bndmp2a基因和/或bndmp1c基因和/或bndmp2c基因的表达或敲除油菜中bndmp1a基因和/或bndmp2a基因和/或bndmp1c基因和/或bndmp2c基因，得到转基因油菜，即为油菜单倍体诱导系；

52、当所述受体植物为烟草时，所述基因为ntdmp1基因和/或ntdmp2基因和/或ntdmp3基因；所述方法为抑制烟草中ntdmp1基因和/或ntdmp2基因和/或ntdmp3基因的表达或敲除烟草中ntdmp1基因和/或ntdmp2基因和/或ntdmp3基因，得到转基因烟草，即为烟草单倍体诱导系；

53、当所述受体植物为棉花时，所述基因为ghdmp1基因和/或ghdmp2基因；所述方法为抑制棉花中ghdmp1基因和/或ghdmp2基因的表达或敲除棉花中ghdmp1基因和/或ghdmp2基因，得到转基因棉花，即为棉花单倍体诱导系。

54、当所述受体植物为大豆时，所述基因为gmdmp1基因和/或gmdmp2基因；所述方法为抑制大豆中gmdmp1基因和/或gmdmp2基因的表达或敲除大豆中gmdmp1基因和/或gmdmp2基因，得到转基因大豆，即为大豆单倍体诱导系。

55、更进一步的，所述敲除受体植物中编码上述蛋白质的基因的方式均为crispr/cas9。

56、所述敲除受体植物中编码上述蛋白质的基因的方法包括如下步骤：将含有靶序列的crispr/cas9载体导入受体植物中，得到转基因植物。所述靶序列靶向受体植物中的靶基因。

57、所述编码上述蛋白质的基因为序列1或序列3或序列5或序列7或序列9或序列11或序列13或序列15第33-767位或序列17第32-434位所示的dna分子。

58、在本发明的一个具体实施例中，当所述受体植物为烟草时，所述crispr/cas9的靶序列为序列7第111-130位、序列7第278-297位、序列5第88-107位和序列5第383-402位。所述含有靶序列的crispr/cas9载体具体为将序列19所示的dna分子插入pdirect-22c载体后得到的载体。所述植物单倍体诱导系具体可为ntdmp基因突变纯合型株系ntdmp-1或ntdmp基因突变纯合型株系ntdmp-2。所述ntdmp基因突变纯合型株系ntdmp-1与野生型烟草k326的基因组dna的差异仅在于在编码ntdmp1的基因的两条同源染色体上均发生了碱基g缺失和片段缺失，该缺失碱基g位于序列5第91位，该缺失片段位于序列5第115-399位，且在编码ntdmp2的基因的两条同源染色体上均发生了片段缺失，该缺失片段位于序列7第116-281位，且在编码ntdmp3的基因的两条同源染色体上均发生了碱基g缺失和片段缺失，该缺失碱基g位于序列9第91位，该缺失片段位于序列9第115-399位。所述ntdmp基因突变纯合型株系ntdmp-2与野生型烟草k326的基因组dna的差异仅在于在编码ntdmp1的基因的两条同源染色体上均发生了碱基g缺失和碱基a缺失，该缺失碱基g位于序列5第91位，该缺失碱基a位于序列5第114位，且在编码ntdmp2的基因的两条同源染色体上均发生了碱基替换，该碱基替换为将序列7第111-280位所示的dna分子替换为碱基t，且在编码ntdmp3的基因的两条同源染色体上均发生了碱基a插入，该插入碱基a位于序列9第400-401位之间。

59、本发明还提供了一种植物单倍体的制备方法。

60、本发明提供的植物单倍体的制备方法包括如下步骤：将按照上述植物单倍体诱导系的制备方法制备的植物单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他植物材料进行杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述植物单倍体。

61、进一步的，上述植物单倍体的制备方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行荧光标记鉴定和/或单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为植物单倍体。

62、更进一步的，所述荧光标记鉴定方法可按照如下方法进行：将携带荧光蛋白表达元件的上述植物单倍体诱导系作为父本与母本杂交，得到杂交子代，通过检测杂交子代种子是否具有荧光信号判断待测种子为单倍体还是四倍体(二倍体)：若待测种子无荧光或弱荧光，则该种子为或候选为单倍体；若待测种子表现出强荧光，则该种子为或候选为四倍体(二倍体)。进一步的，通过荧光灯检测待测种子是否具有荧光。更进一步的，所述父本携带有由启动子atoleo1驱动的tagrfp荧光蛋白表达元件，可以根据杂交后代种子是否具有红色荧光判断其为单倍体还是四倍体(二倍体)。

63、所述单倍体性状鉴定方法可按照如下方法进行：若待测植株具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株具有植株高大，叶片宽大，披散，育性正常等特征，则该植株为或候选为四倍体(二倍体)。

64、所述叶片倍性鉴定方法可按照如下方法进行：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以四倍体(二倍体)植物叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测四倍体(二倍体)细胞核信号，并将四倍体(二倍体)细胞核信号峰位设为100(由于四倍体(二倍体)细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的信号峰出现在100附近，其与四倍体(二倍体)细胞核信号强度富集位置相同，则该植株为或候选为四倍体(二倍体)。

65、所述分子标记鉴定可按照如下方法进行：采用父本(母本单倍体诱导系)和母本间多态性引物进行pcr扩增，根据pcr扩增产物判断待测植株为单倍体还是四倍体(二倍体)：若待测植株的扩增产物仅具有母本的带型，不存在父本的带型，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的扩增产物具有父本和母本的杂合带型，则该植株为或候选为四倍体(二倍体)。

66、上述任一所述应用或方法，所述植物为双子叶植物；进一步的，所述双子叶植物可为胡萝卜、向日葵、番木瓜、甜菜、甜瓜、苜蓿、核桃、芝麻、橡胶树、木薯、荷花、甜樱桃、月季、马铃薯、葡萄、大豆、番茄、黄瓜、辣椒、棉花、烟草或油菜；更进一步的，所述油菜具体可为野生型油菜westar或hau-a；所述烟草具体可为野生型烟草k326；所述棉花具体可为野生型棉花华棉1号；所述大豆具体可为野生型威廉姆斯82。

67、本发明最后提供了一种单倍体诱导能力降低或果实数目提高的转基因植物的制备方法。

68、本发明提供的单倍体诱导能力降低或果实数目提高的转基因植物的制备方法包括如下步骤：提高植物单倍体诱导系中上述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的单倍体诱导能力低于所述植物单倍体诱导系，所述转基因植物的果实数目高于所述植物单倍体诱导系。

69、进一步的，所述提高植物单倍体诱导系中上述蛋白质的表达量和/或活性的方法为在植物单倍体诱导系中过表达上述蛋白质。

70、所述过表达的方法为将编码上述蛋白质的基因导入植物单倍体诱导系中。

71、更进一步的，所述编码上述蛋白质的基因为序列1或序列3或序列5或序列7或序列9或序列11或序列13或或序列15第33-767位或序列17第32-434位所示的dna分子。

72、所述植物单倍体诱导系为敲除基因atdmp8(atdmp8基因序列如序列表中序列20第95-826位所示)和atdmp9(atdmp9基因序列如序列表中序列21第141-875位所示)的拟南芥突变体，如拟南芥dmp基因突变体dmp8dmp9(t2-19-1)，与野生型拟南芥col-0的基因组dna相比，拟南芥dmp基因突变体dmp8dmp9(t2-19-1)的差异仅在于在编码atdmp8蛋白的基因的两条同源染色体上均发生了片段缺失，该缺失的片段位于序列20第115-511位，且在编码atdmp9蛋白的基因的两条同源染色体上均发生了片段缺失，该缺失的片段位于序列21第161-564位。

73、本发明在克隆孤雌生殖单倍体关键诱导基因dmp的基础上，通过遗传互补的方式验证了不同双子叶作物中dmp同源基因的单倍体诱导功能的保守性，具体方法如下：通过基因合成或者是pcr扩增的方式克隆不同双子叶作物中dmp同源基因，构建拟南芥中atdmp9基因的启动子分别驱动这些双子叶作物中dmp同源基因的表达载体，并将所构建的表达载体转化至拟南芥dmp8dmp9突变体中，通过观察携带表达载体与不携带表达载体的植株角果结实数目，证明这些双子叶作物中dmp同源基因均与孤雌生殖单倍体诱导相关，说明不同双子叶作物中dmp同源基因的单倍体诱导功能具有较高的保守性。进一步的，本发明利用基因编辑技术编辑重要的双子叶作物烟草中的dmp同源基因，获得了孤雌生殖单倍体诱导系，再次证明双子叶作物烟草中dmp基因均具有调控植物单倍体诱导能力的功能。本发明所建立的双子叶作物单倍体诱导方法为作物育种共性核心技术的创新及应用展现了广阔前景。