墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用

本发明属于分子生物学dna标记，尤其涉及墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用。

背景技术：

1、墨西哥湾扇贝原产于美国，主要分布在美国东部大西洋沿岸新泽西州至佛罗里达州之间的海域，由于其双壳比海湾扇贝更加膨凸，出柱率高于海湾扇贝。与海湾扇贝相比，墨西哥湾扇贝具有出肉率高、出柱率高、生长快、适合在中国南方海域养殖等特点。尤其是养殖周期较短，能够避开台风以减少损失，受到业界青睐。至2014年，其养殖面积已超过6600hm2，成为北部湾海域贝类养殖的重要产业。但是墨西哥湾扇贝引种至今已近30年，随着养殖世代的增加，加上近交和瓶颈效应，该品种出现了抗逆性降低、生长速度减慢、个体小型化、死亡率升高等一系列问题，养殖效益严重下滑。

2、微卫星dna(microsatellite dna)，又称简单重复序列(simple sequencerepeats，ssr)，是目前应用最为广泛的分子标记之一，其核心重复序列一般为1-6个碱基，如(ca)n、(gt)n、(cag)n、(agct)n等，首尾相连组成的串联重复序列，长度一般在100bp以内。微卫星标记在家系建立、减少或避免近交衰退，个体识别和亲缘关系鉴定等工作中具有重要作用。

3、申请号为201410750857.5中国专利，其公开了14个管角螺微卫星位点及其引物，所获引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，用于管角螺的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方法；但是没有给出具体的应用方法和应用结果分析。

4、现阶段，尚无一种对墨西哥扇贝的系统性遗传特征分析方法，为解决该品种容易出现的抗逆性降低、生长速度减慢、个体小型化、死亡率升高等一系列问题，养殖效益严重下滑，因此对墨西哥湾扇贝进行种质资源改良已经迫在眉睫，为进一步了解墨西哥湾扇贝养殖群体的遗传特征，为墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据，对墨西哥湾扇贝进行微卫星标记、遗传信息的有效分析十分迫切。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用，针对墨西哥湾扇贝出现的养殖问题，开发筛选出微卫星分子标记，并利用微卫星标记分析墨西哥湾扇贝的遗传多样性，为了解墨西哥湾扇贝养殖群体的遗传特征、墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据。

2、为此本发明采用以下技术方案：

3、一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物，墨西哥湾扇贝的多态性微卫星位点序号、及用于扩增所述墨西哥湾扇贝微卫星位点的特异引物对包括如下20个中的任一个，其的特征如下：

4、

5、

6、进一步的，所述墨西哥湾扇贝微卫星位点在基因库中对应的编号位置如下：

7、

8、本发明提供一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的构建方法，微卫星位点的筛选方法包括如下步骤：

9、(1)提取墨西哥湾扇贝的基因组dna；

10、(2)以步骤(1)所述dna为模板dna，将所述模板dna进行酶切，得到酶切dna片段；

11、(3)接头的制备与连接：各取序列为sau a：gatcgtcggtaccgaattct和sau b：gtcaagaattcggtaccgtcgac的引物，混合置于灭菌pcr管中，将所述pcr管放于pcr仪中进行变性处理，所得即为接头；再利用t4dna连接酶将所述接头和步骤(2)所得dna片段进行连接，得到连接产物；

12、(4)以连接产物作为模板，以sau a：gatcgtcggtaccgaattct作为引物，进行pcr扩增，得到第一次扩增产物；

13、(5)以第一次扩增产物为模板dna，将生物素标记探针、第一次扩增产物混合进行杂交反应，得到杂交混合液；再将杂交混合液与磁珠充分混合，得到含有微卫星序列的dna单链片段；

14、(6)以含有微卫星序列的dna单链片段作为模板，以sau a：gatcgtcggtaccgaattct作为引物，进行pcr扩增，纯化后得到第二次扩增产物；

15、(7)将第二次扩增产物进行富集片段的克隆和筛选，然后进行测序，使用软件ssrhunter对测序结果中含有的微卫星核心序列进行查找，使用primer 5.0软件设计引物，引物设计原则：退火温度为55-60℃，引物长度为18-25bp，(g+c)含量为45％-55％；再将选出的引物进行引物合成，得到合成的引物；

16、(8)以墨西哥湾扇贝dna为模板，将合成的引物进行退火温度梯度pcr扩增，所得pcr产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出能获得清晰条带的引物，并调节pcr反应条件以确定每对引物的最适退火温度；

17、将所述筛选出能获得清晰条带的引物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行群体多态性分析，筛选出20对具有多态性的特异引物。

18、进一步地，在步骤(2)中，所述酶切方法是用sau3ai限制性核酸内切酶对墨西哥湾扇贝基因组dna进行酶切，于温度37℃反应4h得到反应液，取4μl反应液混合6×loadingbuffer后，在1.2％的琼脂糖胶上电泳30min检测酶切反应是否完全，并用北京康为世纪公司的dna胶回收试剂盒回收酶切300-1000bp的dna片段；其中，所述酶切的反应体系为50μl，包含40μl的模版dna、0.6μl的sau3ai、5μl的10×buffer、4.4μl的ddh2o。

19、进一步地，在步骤(3)中，所述变形处理的操作温度为95℃，处理时间为10min。

20、进一步地，在步骤(4)中，所述连接产物制作模板的方法是：取3μl步骤(3)所述连接产物置于新的灭菌pcr管中，加入27μl ddh2o，用稀释后的连接产物作为模板；

21、所述pcr扩增的方法是：用稀释后的连接产物作为模板，以10μmol/l的sau a作为引物，进行pcr扩增；pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，得到第一次扩增产物，4℃保存产物；

22、所述扩增的反应体系为25μl，包含1μl模版dna、2μl sau a、0.4μl的taq酶、5μl的5×buffer、2μl的mg2+、1μl dntp、13.6μl的ddh2o。

23、进一步地，在步骤(5)中，所述生物素标记探针是：以生物素标记的(ca)16和(ga)16为探针序列；

24、所述杂交反应体系为100μl，包含15μl的20×ssc、10μl模版dna、200pmol的生物素标记探针。

25、进一步地，在步骤(6)中，所述pcr扩增的反应体系为25μl，包含6μl的模版dna、2μl的sau a、0.4μl的taq酶、1μl dntp、2μl的mg2+、5μl的5×buffer、8.6μl的ddh2o；

26、所述pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存产物；

27、所述纯化是利用pcr纯化试剂盒回收纯化。

28、进一步地，在步骤(8)中，所述pcr扩增的反应体系为10μl，包含1μl的模版dna、1μl的10×buffer、0.25u的taq酶、1.5mm的mg2+、10μm引物r、10μm引物f、2mm dntp、4.35μl的ddh2o；

29、所述pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃预变性45s，退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存产物。

30、本发明提供一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的应用，是对墨西哥湾扇贝遗传多样性分析，包括如下步骤：

31、(1)提取墨西哥湾扇贝的基因组dna；

32、(2)以墨西哥湾扇贝的特异引物对、步骤(1)所述基因组dna，进行pcr扩增，得到扩增产物；扩增产物的通过采用8％非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，以10bp dnaladder为对照，银染显色，使用凝胶扫描仪进行扫描；所述pcr扩增的反应体系和反应程序与步骤(8)中相同。

33、(3)用popgene软件计算每个位点的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度和期望杂合度；用软件cervus计算每个位点的多态信息含量；用genpop软件根据等位基因频率对各群体各个位点进行哈迪-温伯格平衡的检验；用popgene软件对各群体间的遗传距离进行计算，使用mega7.0软件根据各群体间的遗传距离构建聚类关系树。

34、本发明所用原料如下，限制性核酸内切酶sau3ai、链亲和素免疫磁珠、10×buffer(含mg2+)、taq dna聚合酶(5u/μl)购自promega公司；t4 dna连接酶(350u/μl)、质粒pmdtm20-t载体、6×loading buffer购自takara生物公司；dntp(2.5mmol/l)、40％丙烯酰胺/甲双叉丙烯酰胺母液、lb固体培养基、过硫酸铵(aps)、temed(n,n,n',n'-四甲基二乙胺)、lb液体培养基购自生工生物(上海)工程有限公司；dm2000 dna marker、氨苄青霉素(amp)、pcr纯化试剂盒、蛋白酶k、dna胶回收试剂盒购自北京康为世纪有限公司；mg2+(25mmol/l)、dh5α感受态细胞、5×buffer购自全式金(北京)生物有限公司；10bp dnaladder购自invitrogen(上海)生物技术有限公司；常用试剂agno3(分析纯)、nacl(分析纯)、na2edta·2h2o(二水合二胺四乙酸二钠)、无水乙醇(分析纯)、na2co3(分析纯)、naoh(分析纯)、sds(十二烷基磺酸钠)、甲醛溶液等购自上海国药有限公司；实验所需的引物、接头、探针均由生工生物(上海)工程有限公司合成。

35、所述合成的通用引物及序列如下：

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37、本发明以墨西哥湾扇贝为研究对象，运用磁珠富集法筛选墨西哥湾扇贝微卫星分子标记，并利用微卫星标记对墨西哥湾扇贝的遗传多样性进行评价。由测序得到的微卫星序列设计并获得了20对能够在墨西哥湾扇贝基因组有效扩增且具有多态性的微卫星引物。本发明有助于了解墨西哥湾扇贝的遗传特征，为墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据。

38、本发明具有以下有益效果：

39、1.本发明利用磁珠富集法首次开发墨西哥湾扇贝微卫星标记，以生物素标记的(ca)16和(ga)16为探针来捕获微卫星序列，结果获得了大量的微卫星序列，证明墨西哥湾扇贝中含有丰富的(ca/gt)n和(ga/ct)n，微卫星核心序列具有高重复数，高达35次，表现出高度多态性。

40、2.本发明方法有助于了解墨西哥湾扇贝的遗传特征，为墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据。