一种检测基因多态性的qPCR方法与流程

本发明涉及生物检测，具体涉及一种检测基因多态性、无需荧光探针的qpcr方法。

背景技术：

1、遗传多态性是在同一群体中，某个基因座上存在两个或两个以上的等位基因，且等位基因的频率大于0.01的现象，其形成机制是基因突变。评价遗传多态性的主要参数是基因频率、基因型频率及表型频率。

2、基因多态性中，有单碱基多态性、基因插入、基因缺失或短重复序列数目的差异。以单碱基多态性最常见。生物品种数量繁多，各品种的特性由基因所决定。在化学本质上，基因由一系列不同排列的碱基序列构成，这些碱基为a、t或u、c、g。在同一物种的不同个体中，基因结构平均每一千个碱基就有一个碱基可能不同。单个碱基的不同，称单碱基多态性。其频率在不同基因又有不同，假基因中大约为0.11％，内含子中约为0.1％，外显子中则低于0.1％。

3、基因多态性分析检测，具有广泛的理论和实用价值，包括发育学研究、生物进化研究、疾病病因分析、药物研制和新药开发、农业育种等等。在医药卫生中意义尤为重大。有些遗传病直接与基因多态性，基因表达高低相关，某些疾病则与基因表达和环境因素相互作用有关。理论认为，类似的疾病可能具有类似的基因背景或类似的基因多态性。

4、检测基因多态性常用的检测方法有sanger测序法、电泳法、taqman探针荧光定量pcr法等。sanger测序是检测的金标准，但该方法周期长、成本高且通量低，难以满足实际应用的需求；电泳法方法简单，成本低，但操作繁琐，存在交叉污染的风险；taqman探针荧光定量pcr法操作简单，通量高，但每个多态性位点均需合成一条mgb探针，成本高。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种检测基因多态性的qpcr方法。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面是提供一种检测基因多态性的qpcr方法，根据基因多态性的种类n(n为2、3、4中的一种)设计n条分别识别各个等位基因的正向引物、1条反向引物和n条序列不同的3’端标记有一淬灭基团的通用序列进行扩增反应；

4、每条正向引物的5’端都额外添加了一段通用核苷酸序列q，与上述通用序列分别反向互补；通用核苷酸序列q的5’端标记有一个荧光基团，每条通用核苷酸序列上标记的荧光基团不同。

5、进一步地，通用核苷酸序列q与待扩增的靶序列匹配度低于20％，长度为18～30bp，tm范围为56℃～60℃。

6、进一步地，上述荧光基团选自fam、vic、cy5、tet、hex、joe、rox中的一种。

7、进一步地，上述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl中的一种。

8、进一步地，扩增采用的反应体系包括引物混合液、10×缓冲液、dntp、无核酸酶水、taq酶和dna模板。

9、进一步地，扩增采用的程序如下：95℃5min；95℃15s，60℃1min，45个循环。

10、本发明的第二方面是提供上述方法在检测ace插入/缺失多态性中的应用，采用的引物和通用序列的序列如seq id no：3～seq id no：7所示；序列如seq id no：3和id no：4所示的引物的5’端分别标记有不同的荧光基团；序列如seq id no：6和id no：7所示的通用序列的3’端含有淬灭基团修饰。

11、进一步地，扩增采用的反应体系包括引物混合液、10×缓冲液、dntp、无核酸酶水、taq酶和dna模板；其中，引物混合液由如下浓度的组分配制而成：10μmace-i-f引物1μl、10μmace-d-f引物0.2μl、10μmace-d/i-r引物1.2μl、10μm通用序列n10.2μl和10μm通用序列n21μl。

12、进一步地，扩增采用的反应体系包括引物混合液3.6μl、10×缓冲液2.0μl、2.5mmdntp 1.6μl、无核酸酶水11.6μl、taq酶0.2μl和10ng/μl dna模板1.0μl。

13、本发明的第三方面是提供一种检测ace插入/缺失多态性的试剂盒，其包括序列如seq id no：3～seq id no：7所示的引物和通用序列；序列如seq id no：3和id no：4所示的引物的5’端分别标记有不同的荧光基团；序列如seq id no：6和id no：7所示的通用序列的3’端含有淬灭基团修饰。

14、进一步地，上述荧光基团选自fam、vic、cy5、tet、hex、joe、rox中的一种。

15、进一步地，上述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl中的一种。

16、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

17、本发明提供的检测基因多态性的qpcr方法仅需根据多态性的种类设计相应条数的带有荧光基团修饰的特异性引物，1条下游引物，相应条数的带有淬灭基团修饰的通用序列，即可准确检测基因的多态性，不需要采用taqman探针，具有操作简单、检测快速、判读清晰准确，且成本低可普遍应用等优点。

技术特征：

1.一种检测基因多态性的qpcr方法，其特征在于，根据基因多态性的种类n(n为2、3、4中的一种)设计n条分别识别各个等位基因的正向引物、1条反向引物和n条序列不同的3’端标记有一淬灭基团的通用序列进行扩增反应；

2.根据权利要求1所述的qpcr方法，其特征在于，所述通用核苷酸序列q与待扩增的靶序列匹配度低于20％，长度为18～30bp，tm范围为56℃～60℃。

3.根据权利要求1所述的qpcr方法，其特征在于，所述荧光基团选自fam、vic、cy5、tet、hex、joe、rox中的一种。

4.根据权利要求1所述的qpcr方法，其特征在于，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl中的一种。

5.根据权利要求1所述的qpcr方法，其特征在于，所述扩增采用的反应体系包括引物混合液、10×缓冲液、dntp、无核酸酶水、taq酶和dna模板。

6.根据权利要求1所述的qpcr方法，其特征在于，所述扩增采用的程序如下：95℃5min；95℃15s，60℃1min，45个循环。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法在检测ace插入/缺失多态性中的应用，其特征在于，采用的引物和通用序列的序列如seq id no：3～seq id no：7所示；序列如seq id no：3和id no：4所示的引物的5’端分别标记有不同的荧光基团；序列如seq id no：6和id no：7所示的通用序列的3’端含有淬灭基团修饰。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，扩增采用的反应体系包括引物混合液、10×缓冲液、dntp、无核酸酶水、taq酶和dna模板；其中，引物混合液由如下浓度的组分配制而成：10μmace-i-f引物1μl、10μmace-d-f引物0.2μl、10μmace-d/i-r引物1.2μl、10μm通用序列n10.2μl和10μm通用序列n21μl。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，扩增采用的反应体系包括引物混合液3.6μl、10×缓冲液2.0μl、2.5mm dntp 1.6μl、无核酸酶水11.6μl、taq酶0.2μl和10ng/μl dna模板1.0μl。

10.一种检测ace插入/缺失多态性的试剂盒，其特征在于，包括序列如seq id no：3～seq id no：7所示的引物和通用序列；序列如seq id no：3和id no：4所示的引物的5’端分别标记有不同的荧光基团；序列如seq id no：6和id no：7所示的通用序列的3’端含有淬灭基团修饰。

技术总结
本发明提供了一种检测基因多态性的qPCR方法，根据基因多态性的种类n(n为2、3或4)设计n条分别识别各个等位基因的正向引物、1条反向引物和n条序列不同的3’端标记有一淬灭基团的通用序列进行扩增反应；每条正向引物的5’端都额外添加了一段通用核苷酸序列Q，与通用序列分别反向互补；通用核苷酸序列Q的5’端标记有一个荧光基团，每条通用核苷酸序列上标记的荧光基团不同。该方法仅需根据多态性的种类设计相应条数的带有荧光基团修饰的特异性引物，1条下游引物，相应条数的带有淬灭基团修饰的通用序列，即可准确检测基因的多态性，不需要采用Taqman探针，具有操作简单、检测快速、判读清晰准确且成本低可普遍应用等优点。

技术研发人员：雷煜兰,郭亮
受保护的技术使用者：上海科医联创医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22