本发明涉及一种退火致相分离体系的荧光rna传感器、构建方法及其应用，属于生物分析测试。
背景技术：
：：1、rna传感器是一种基于荧光rna适配体(fluorescent rnas)开发而来的生物传感器，其能够在特定目标分子存在的情况下，高效地结合并激活荧光染料，目前被大量用于活细胞成像等工作。rna传感器能够凭借高亲和力和高特异性与目标分子结合形成稳定的复合物，加入荧光染料后与荧光染料结合，并激活荧光染料使荧光染料发出荧光。在没有目标分子的情况下，其rna空间结构不满足与荧光染料结合的条件，故单独加入荧光染料不发出荧光。利用这种特性，通过检测rna传感器与目标分子结合后所激发染料的荧光信号强弱，来实现对目标分子的定性和定量分析。rna传感器具有高灵敏度、高亲和力、高特异性等优点，在生物医学、环境监测等领域发挥重要作用(chen,x.,zhang,d.,su,n.etal.visualizing rna dynamics in live cells with bright and stable fluorescentrnas.nat biotechnol,2019,37,1287-1293)。2、然而，传统rna传感器在实际应用过程中存在诸多挑战，例如rna传感器在细胞内亮度低信噪比低，易被细胞内存在的酶降解，荧光检测过程中光稳定性较差等。为了有效解决这些问题，相分离体系的荧光rna传感器被提出。相分离所形成的液滴状颗粒结构可以保护rna，减少外界环境的影响，从而提高rna的稳定性。又由于其在空间上的聚集，使得荧光信号得以增强，提高了亮度和信噪比。在体外，利用rna降解酶rnase进行模拟，实验证明，发生相分离后所形成的液滴状颗粒结构，能够大大减缓rna序列被降解的时间，有效的提高抗光漂白能力和抗酶降解能力(xue,z.,ren,k.et al.targeted rna condensation inliving cells via genetically encodable triplet repeat tags.biorxiv,2023.04.07,536084)。3、银自公元前1世纪以来就开始被用于消毒。与会引起耐药致病菌株的抗生素相比，银在预防和治疗感染方面更具优势，银纳米颗粒(agnps)在医疗设备、手术涂层、纺织品和水消毒等方面有着广泛的应用。已知agnps的抗菌作用与ag+在细胞内的积累密切相关。ag+可以与蛋白质中的巯基相互作用，干扰dna复制，阻止细菌增殖。目前已经开发了几种体外测量ag+的策略，如利用原子光谱法、电位法、和荧光光谱法等。然而，这些体外测定方法不能用于测量ag+的细胞内浓度。文献公开了一种名为broccoli的荧光rna适配体开发的rna传感器，在特定点位错配两个脱氧胞嘧啶核苷酸，利用胞嘧啶-ag+-胞嘧啶金属碱基对的形成，恢复荧光rna适配体部分的空间结构，从而结合荧光染料产生荧光信号，可以选择性地成像活细胞中的ag+，然而该成像功能仍然存在易被细胞降解、受生物功能干扰等问题(yu,q.,shi,j.et al.genetically encoded rna-based sensors for intracellularimaging of silver ions.chem.commun.,2019,55,707-710)。技术实现思路1、本发明提供一种退火致相分离体系的荧光rna传感器、构建方法及其应用。该方法利用在高温下，rna的所有氢键被破坏，从而破坏了寡核苷酸内的全部二级结构，然后在一定条件下缓慢冷却促进相分离的发生，形成液滴状颗粒结构，构建的传感器可用于检测ag+，具有高特异性和高稳定性。2、本发明的技术方案如下：3、退火致相分离体系的荧光rna传感器，为rna单链在退火的作用下自组装聚集在一起形成的液滴状颗粒，其含有荧光适配体、能够特异性识别ag+形成胞嘧啶-ag+-胞嘧啶金属碱基对的两个胞嘧啶核苷酸和能够诱导相分离的多个重复碱基单元，将高结合能力以及高特异性优势相结合，能激活相应的荧光染料的荧光，传感器体系发出的荧光强度随着ag+的浓度显著变化，能够对ag+进行高灵敏度检测，通过以下步骤构建：4、将rna单链与缓冲溶液混合后退火，退火过程为92～98℃保温3～5分钟，然后降至37℃，得到发生相分离后形成的液滴状rna颗粒溶液，即为荧光rna传感器，所述的缓冲溶液的组成为：10mm tris、100mm kcl、20mm mgcl2，ph＝7.4，所述的rna单链包括荧光适配体、能够特异性识别ag+形成胞嘧啶-ag+-胞嘧啶金属碱基对的两个胞嘧啶核苷酸和能够诱导相分离的多个重复碱基单元。5、优选的，重复碱基单元为cug，重复碱基单元的个数为31个。6、优选的，混合后，rna单链的终浓度为10μm。7、优选的，降温速率为1.5～2.5℃/min。8、在本发明具体实施方式中，rna单链的碱基序列如seq id no.4所示。9、本发明提供上述荧光rna传感器在荧光检测ag+的应用。10、具体地，应用方法为：将荧光rna传感器与荧光染料和含有ag+的待测溶液混合，形成的反应体系在25℃下孵育2.5h，检测其荧光强度，根据荧光强度与ag+浓度的线性关系，计算得到含ag+的待测溶液中ag+浓度。11、优选的，荧光染料为dfhbi-1t。12、优选的，反应体系中，荧光rna传感器终浓度为0.5～1μm，mg2+浓度为1mm，dfhbi-1t浓度为20μm、ph＝7.4hepes浓度为40mm，kcl浓度为100mm。13、与现有技术相比，本发明具有以下优点：14、(1)本发明利用退火处理具有特殊结构的rna单链，得到的适配体颗粒的kd值为原先的35％，表明其有更快的荧光染料结合能力；连续激光照射2h后，适配体颗粒可以保持95％以上的初始荧光强度，而没有经过退火的适配体单体由于荧光淬灭只有54％的初始荧光强度，可见其抗光漂白能力显著增强；适配体颗粒的抗酶降解能力增强了2.8倍；适配体颗粒的热稳定性增强了10％以上。15、(2)本发明构建的rna传感器颗粒对ag+敏感，能够特异性识别ag+，并具有很低的检测限度整体，能够实现ag+较大检测范围内的高灵敏度检测。技术特征：1.退火致相分离体系的荧光rna传感器的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，重复碱基单元为cug，重复碱基单元的个数为31个。3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，混合后，rna单链的终浓度为10 μm。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，降温速率为1.5~2.5℃/min。5. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，rna单链的碱基序列如seq id no.4所示。6.根据权利要求1~5任一所述的构建方法制得的荧光rna传感器。7.根据权利要求6所述的荧光rna传感器在荧光检测ag+的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：将荧光rna传感器与荧光染料和含有ag+的待测溶液混合，形成的反应体系在25℃下孵育2.5h，检测其荧光强度，根据荧光强度与ag+浓度的线性关系，计算得到含ag+的待测溶液中ag+浓度。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，荧光染料为dfhbi-1t。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，反应体系中，荧光rna传感器终浓度为0.5~1μm，mg2+浓度为1mm，dfhbi-1t浓度为20 μm、ph=7.4 hepes浓度为40mm，kcl浓度为100mm。技术总结本发明公开了一种退火致相分离体系的荧光RNA传感器、构建方法及其应用。所述传感器基于一种包含荧光适配体、能够特异性识别Ag<supgt;+</supgt;形成胞嘧啶‑Ag<supgt;+</supgt;‑胞嘧啶金属碱基对的两个胞嘧啶核苷酸和能够诱导相分离的多个重复碱基单元的RNA适配体，在退火作用下驱动其发生液‑液相分离，从而形成液滴状颗粒结构，利用适配体中两个脱氧胞嘧啶核苷酸与Ag<supgt;+</supgt;特异性结合，恢复RNA结构，结合并激活对应染料的荧光，根据荧光信号强度的变化，实现对Ag<supgt;+</supgt;的检测。本发明的RNA传感器具有优异的热稳定性、抗光漂白能力和抗酶降解能力，能够对Ag<supgt;+</supgt;进行高灵敏检测。技术研发人员：任克维,王龙受保护的技术使用者：南京理工大学技术研发日：技术公布日：2024/1/22