一种提高酶催化活性的方法及应用

本发明涉及酶工程，特别涉及一种提高酶催化活性的方法及应用。

背景技术：

1、酶作为细胞中具有生物催化性能的复杂体系，参与生命所需的几乎所有生化反应，包括能量转换中的氧化还原过程、必需代谢物的生物合成、遗传信息的转录和翻译等，对生命活动发挥着至关重要的作用。酶不仅能降低反应的活化能，还显著提高生物体内发生的化学反应的速率。酶以高效性、特异性和选择性的优势，使其在人们的日常生活和现代工业中也具有重要作用，应用涉及到食品、洗涤、养殖、燃料、医疗诊断和生物医药等方面。

2、酶活性的调控在酶催化研究领域发挥了不可或缺的作用。特别是在最近几年，己经探究了越来越多的方法，旨在调控各种催化体系的酶活性。然而由于酶蛋白是分子量很大的生物大分子，结构复杂，影响因素众多，有效手段还比较缺乏；目前常用的手段包括载体固定化酶修饰、化学共价修饰及蛋白质工程改造等，其中载体固定化酶过程复杂，对载体要求高，容易导致酶失活；化学共价修饰过程需要酶对反应环境的耐受性高，涉及有机溶剂、酸碱等；蛋白质工程需要对酶进行重新设计改造，技术壁垒高，难以推广。因此研究一种简单、通用方法提高酶催化活性对提升酶在各方面的应用具有极大的价值。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的酶催化活性技术壁垒高、环境要求高、酶种类要求高等技术限制的问题，提供一种提高酶催化活性的通用方法。

2、本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的矿化酶。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种提高酶催化活性的通用方法，包括以下步骤：

5、将酶的水溶液与有机硅偶联试剂水溶液混合得到混合溶液，反应，反应后通过超滤管离心分离、洗涤，即可获得纯净的矿化酶。

6、优选地，所述酶包括但不限于核酸合成酶、核酸连接酶、端粒酶、糖异构酶、消旋酶、谷氨酰胺合成酶、醛缩酶、磷酸酶、转甲基酶、磷酸化酶、脱氢酶、过氧化氢酶、酰基转移酶、酰胺酶、转氨酶、酮还原酶、氧化酶、单加氧酶、青霉素酰化酶、水解酶、尿酸酶、髓过氧化物酶、taq dna聚合酶、过氧化氢酶、脂肪酶、细胞色素c酶、葡萄糖氧化酶和酪氨酸酶中的至少一种，更优选包括脂肪酶、细胞色素c酶和葡萄糖氧化酶中的至少一种。

7、优选地，所述的有机硅偶联试剂包括但不限于甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷、四甲氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、苄基三甲氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三甲氧基硅烷、氯三乙氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷中的至少一种，更优选为四乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。

8、优选地，所述的混合溶液中酶的浓度为0.01～50g/l，更优选为0.375～0.4g/l。

9、优选地，所述的混合溶液中有机硅偶联试剂的浓度为0.1～100mmol/l，更优选为:5～25mmol。

10、优选地，所述的酶与有机硅偶联试剂的质量摩尔比为：0.01～50g:0.1～100mmol；更优选为0.375～0.4g:5～25mmol。

11、优选地，所述的反应的温度为4～37℃，更优选为4℃。

12、优选地，所述的反应的时间为30～300min，更优选为30～180min；最优选为30～90min。

13、优选地，所述的通过超滤管离心分离为通过10kda超滤管，转速为3000r/min下离心30min。

14、一种矿化酶，通过上述方法制备得到。

15、一种提高脂肪酶酶活的方法，包括以下步骤：

16、将脂肪酶的水溶液与有机硅偶联试剂水溶液混合得到混合溶液，反应，反应后通过超滤管离心分离、洗涤，即可获得纯净的矿化酶；

17、所述的有机硅偶联试剂为四乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷中的至少一种；

18、所述的酶与有机硅偶联试剂的质量摩尔比为：0.4g:5mmol；

19、所述的反应的时间为30～180min。

20、优选地，所述的有机硅偶联试剂为四乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷按摩尔比0:0:100、0:80:20、10:60:30、10:80:10或20:60:20组成。

21、优选地，所述的反应的温度为4～37℃，更优选为4℃。

22、一种提高细胞色素c酶的方法，包括以下步骤：

23、将细胞色素c酶的水溶液与有机硅偶联试剂水溶液混合得到混合溶液，反应，反应后通过超滤管离心分离、洗涤，即可获得纯净的矿化酶；

24、所述的有机硅偶联试剂为四乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷中的至少一种；

25、所述的酶与有机硅偶联试剂的质量摩尔比为：0.4g:5～25mmol；

26、所述的反应的时间为30～180min。

27、优选地，所述的有机硅偶联试剂为四乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷按摩尔比0:0:100、0:80:20、10:20:70或20:20:60组成。

28、优选地，所述的反应的温度为4～37℃，更优选为4℃。

29、一种提高葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：

30、将葡萄糖氧化酶的水溶液与有机硅偶联试剂水溶液混合得到混合溶液，反应，反应后通过超滤管离心分离、洗涤，即可获得纯净的矿化酶；

31、所述的有机硅偶联试剂为四乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷中的至少一种；

32、所述的酶与有机硅偶联试剂的质量摩尔比为：0.375g:5～15mmol；

33、所述的反应的时间为30～180min。

34、优选地，所述的有机硅偶联试剂为四乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷按摩尔比30:40:30、20:60:20、15:70:15或80:15:5组成。

35、优选地，所述的反应的温度为4～37℃，更优选为4℃。

36、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

37、本发明提供一种提高酶催化活性的通用方法，该方法只需简单调控有机硅偶联试剂与酶的比例、有机硅偶联试剂的种类和比例及反应时间即可提高酶的催化活性，且可快速探索合适的反应条件来达到酶活的最高增幅。原料便宜，方法简单，无需复杂操作，反应环境与过程温和，该方法对酶具有普适性，适用于多种酶，无需复杂的蛋白改造和共价化学反应和复杂提纯，对设备要求低，可批量操作，具有极大的应用价值。

技术特征：

1.一种提高酶催化活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，

8.根据权利要求7中所述的方法，其特征在于，

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

10.一种矿化酶，其特征在于，通过权利要求1～9任一项所述的方法制备得到。

技术总结
本发明公开了一种提高酶催化活性的方法及应用，属于酶催化活性调控研究领域。本发明的方法实现了通过化学手段在单分子酶水平对酶进行修饰改造，只需在水溶液中简单调控有机硅偶联试剂与酶的比例、有机硅偶联试剂的比例及反应时间即可显著提高酶的催化活性，且可快速获取合适的反应条件来达到酶活的最高增幅。该方法对酶具有普适通用性，适用于多种酶，其中脂肪酶的催化活性最高提高幅度为195.08％，细胞色素C酶最高提高幅度为143.12％，葡萄糖氧化酶催化活性最高提高幅度为125.97％。该方法步骤简单，无需复杂的蛋白改造和共价化学反应，对技术操作人员友好，具有极大应用价值。

技术研发人员：朱伟,郑观生
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5