利用CRISPR-Cas9条件性敲除肝脏Ip6k3基因动物模型的构建方法与流程

本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种利用crispr-cas9条件性敲除肝脏ip6k3基因动物模型的构建方法。

背景技术：

1、随着现代社会物质生活的丰富，饮食质量的提高，更多的碳水化合物和能量被摄入，可导致高脂血症、糖尿病等多种代谢性疾病，其中肝脏成为受累最严重的脏器之一。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)是指除酒精和其他明确的肝损因素外，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合症。其包括单纯性脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)、脂肪性肝纤维化和肝硬化。当前临床用于nafld的治疗手段主要是使用包括降脂药、抗糖尿病药、抗氧化药等，国际上仍无针对nafld的特异性药物，因此，寻找治疗nafld可能的药物新靶点和新机制迫在眉睫。采用高脂高糖饮食(high fat/glucose diet，hfgd)喂食12周诱导小鼠代谢综合征模型，随后将ms小鼠进行2周跑台锻炼。结果显示ip6k3在ms模型小鼠的肝脏中被上调12倍，但是在ms小鼠运动后，其表达又被下调4倍。表明ip6k3很有可能是一个ms发病过程中的关键基因，而且可被运动所逆转/减缓。

2、ip6k3属于六磷酸肌醇激酶(inositol hexaphosphate kinases，ip6ks)家族，其作用是负责焦磷酸肌醇的生物合成。在真核细胞中，可溶性和脂质状态的焦磷酸肌醇广泛存在，它们在细胞的发育和生物学功能中起到重要作用。ip6ks是焦磷酸肌醇合成的限速酶，它可以在肌醇环第一位、第三位或第五位已有的磷酸基团上再加一个磷酸基团合成焦磷酸肌醇。ip6ks通过以上过程在dna修复、染色体重组、细胞死亡、凝血作用、造血调控、免疫调控、癌症进展等方面发挥作用。目前研究表明，ip6k3可通过spectrin/adducin调节小脑浦肯野细胞的形态和突触形成，在神经环路的建立中发挥重要作用。ip6k3启动子的多态性还与阿尔兹海默症的晚发有关。由于ip6k3是一个代谢调控酶，全身敲除有可能会导致严重的发育问题或其他潜在问题，所以构建ip6k3肝脏条件性基因敲除小鼠模型尤为必要。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了提供一种利用crispr-cas9条件性敲除肝脏ip6k3基因动物模型的构建方法，采用本发明提供的方法能够得到敲除ip6k3基因动物模型。本发明构建的ip6k3小鼠模型稳定性强，能够稳定遗传，为进一步研究代谢综合征等发病机制及基因治疗提供了经济、简单、可靠的动物模型。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、一种利用crispr-cas9条件性敲除肝脏ip6k3基因动物模型的构建方法，具体步骤如下：

4、s1、针对ip6k3基因的第3外显子，选择2个sgrna的作用靶点，基于crispr-cas9系统设计两对sgrna序列；

5、s2、体外转录步骤s1中得到的sgrna和cas9核酸酶的mrna，构建供体载体，将mrna、sgrna和供体载体混合后通过显微注射法注射到野生型小鼠的受精卵中，将受精卵移植到假孕母鼠体内，繁殖获得f0代小鼠；

6、s3、将携带flox位点的阳性f0代小鼠与野生型小鼠交配获得f1代杂合子小鼠，将f1代小鼠中携带flox位点的杂合转基因小鼠自交，得到携带flox位点的阳性f2代小鼠，将携带flox位点的阳性f2代小鼠与alb-cre阳性小鼠交配，得到ip6k3肝脏条件性基因敲除动物模型。

7、进一步地，步骤s1中，所述两对sgrna序列分别为grna-a和grna-b。

8、上述更进一步地，所述grna-a包括：

9、grna-a1：5’-gatgacggctgggtaccgatggg-3’，其核苷酸序列如seq id no.1所示，

10、grna-a2：5’-ttaagtttttggttcagcgcagg-3’，其核苷酸序列如seq id no.2所示；

11、所述grna-b包括：

12、grna-b1：5’-ttcagccagcgatgacggctggg-3’，其核苷酸序列如seq id no.3所示，

13、grna-b2：5’-taagtttttggttcagcgcaggg-3’，其核苷酸序列如seq id no.4所示。

14、进一步地，步骤s2中，所述供体载体包括5’同源臂、flox区域、3’同源臂、用于连接5’同源臂与flox区域的第一loxp元件以及用于连接3’同源臂与flox区域的第二loxp元件，其中flox区域包括与ip6k3基因第3外显子的dna序列同源的序列，5’同源臂为与ip6k3基因上flox区域所对应区域相间隔的一段上游dna序列的同源序列，3’同源臂为与ip6k3基因上flox区域所对应区域相间隔的一段下游dna序列的同源序列。

15、上述更进一步地，所述flox区域大小为1276bp。

16、进一步地，步骤s2中，所述野生型小鼠为c57bl/6j小鼠。

17、进一步地，步骤s2中，对f0代小鼠进行pcr鉴定和测序验证携带flox位点的阳性f0代小鼠。

18、上述更进一步地，所述pcr鉴定的特异性引物包括：

19、ip6k3-f1：5’-tgctattatcttcagccagcgat-3’，其核苷酸序列如seq id no.5所示，

20、ip6k3-r1：5’-atcctctcatctgtcttcatccag-3’，其核苷酸序列如seq id no.6所示，

21、ip6k3-f2：5’-tgataactgtctgctgacctttcc-3’，其核苷酸序列如seq id no.7所示，

22、ip6k3-r2：5’-ccttctagagtatgctctgcatctt-3’，其核苷酸序列如seq id no.8所示，

23、alb-f1：5’-gaagcagaagcttaggaagatgg-3’，其核苷酸序列如seq id no.9所示，

24、alb-r1：5’-ttggccccttaccataactg-3’，其核苷酸序列如seq id no.10所示。

25、一种ip6k3基因在制备小脑浦肯野细胞形态改变和突触数量减少动物模型中的应用。

26、一种ip6k3基因在制备代谢综合征动物模型中的应用。

27、一种敲除ip6k3基因在制备治疗脂肪肝引起的糖脂代谢紊乱药物中的应用。

28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

29、1、本发明利用crispr-cas9基因敲除技术，敲除ip6k3基因，ip6k3基因敲除后的小鼠表现出小脑浦肯野细胞形态改变、突触数量减少和运动学习和协调方面的缺陷；

30、2、本发明构建的ip6k3小鼠模型稳定性强，能够稳定遗传，为进一步研究代谢综合征等发病机制及基因治疗提供了经济、简单、可靠的动物模型。