一种高稳定性葡聚糖酶突变体及其应用的制作方法

：本发明属于生物工程，特别涉及一种高稳定性的葡聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

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背景技术：

1、葡聚糖是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分，是世界上存在量最大的可再生生物资源之一。植物茎秆及果实被大量用于动物饲料，但是葡聚糖作为饲料中的非淀粉多糖难以被动物(特别是单胃动物)消化吸收，并且能使消化道食糜粘度增加，导致日粮养分消化率和饲养效果降低，限制了含葡聚糖植物资源在饲料中的添加应用。近年，随着生物技术的进步，我们已经了解葡聚糖酶等非淀粉多糖酶可以分解此类多糖，消除其抗营养作用。

2、葡聚糖酶(dextranase)又名内切纤维素酶，是纤维素酶复合酶系中的一种，作用是随机水解非结晶纤维素分子内糖苷键，促使粘度降低，还原性末端增多。由于国家饲料添加剂新标准的实施，对激素类添加剂的严格要求，纯天然的生物酶制剂作为饲料添加剂是近年的热门研究方向。葡聚糖酶分解非淀粉多糖，能消除其对动物抗营养作用，但是由于微生物发酵葡聚糖酶酶活力较低导致生产成本较高，限制了葡聚糖酶在饲料行业的应用。目前酶制剂行业葡聚糖酶活力低的原因主要有两点：1、原始菌种产酶效率低。2、葡聚糖酶分子稳定性差，酶蛋白分泌后很快失活变性导致产率降低，不适宜动物体内复杂消化环境。这是饲料酶制剂行业亟需解决的问题。

3、微生物来源葡聚糖酶主要为真菌葡聚糖酶，其中黑曲霉菌是目前研究较多的产葡聚糖酶菌种，由于其安全性得到广泛认同，是广泛应用于食品及药品行业的酶制剂生产菌。n+离子注入诱变育种，是指通过设备产生高能粒子束并注入生物体，引起生物体遗传物质永久改变，然后从变异菌株中筛选优良菌株的方法。本申请将利用该诱变方法对产葡聚糖酶的黑曲霉菌进行诱变，筛选得到一株产酶菌能够生产稳定性及酶学特性好的葡聚糖酶突变体，进一步通过基因工程手段，获得该葡聚糖酶突变体氨基酸与核苷酸序列，并且通过构建相应的毕赤酵母工程菌，使其高表达，对满足饲料加工工业生产的需求，降低生产成本具有重大意义。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、为了解决上述技术问题，本发明将提供一种高稳定性葡聚糖酶突变体及其应用，解决目前饲料加工行业对高稳定性葡聚糖酶的需求问题。

2、所述的酶分子的稳定性主要表现在热稳定性好与耐酸碱稳定性提升两方面。本发明的目的可以通过以下措施来实现：

3、一种稳定性好的葡聚糖酶突变体的获得，首先由申请人实验室保藏的野生型黑曲霉菌株(aspergillus niger)yp通过n+离子注入诱变筛选获得一株突变菌，将分离出的葡聚糖酶编码基因连接到表达载体，在毕赤酵母gs115中进行表达，获得表达稳定性更好的毕赤酵母工程菌。

4、本发明提供的技术方案之一，是一种葡聚糖酶突变体，所述葡聚糖酶突变体是在seq id no.2所示的野生型葡聚糖酶的基础上，发生105位与111位氨基酸发生突变，105位由丝氨酸(s)突变为亮氨酸(l)，111位由天冬氨酸(d)突变为丙氨酸(a)，所述葡聚糖酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示；

5、进一步地，所述葡聚糖酶突变体的编码基因，核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、本发明制备的葡聚糖酶突变体，酶学特性如下：

7、(1)最适反应温度为35℃，在60℃条件下保温2h酶活保持不变，80℃保温2h，仍能保持80％以上的酶活，热稳定性较好；结果如图1，图2。

8、(2)最适反应ph为6.5，在ph 3.0-12.0的条件下处理2h，结果显示ph3.0-9.0范围内相对酶活力仍然保持在80％以上，结果如图3，图4。

9、本发明提供的技术方案之二，是包含上述葡聚糖酶突变体编码基因的重组载体或重组菌株，将seq id no.3所示葡聚糖酶突变体编码基因重新构建重组载体，并在毕赤酵母gs115中的高效表达，解决原始菌种产酶效率低的问题；

10、进一步地，所述重组载体采用的表达载体为ppic9k质粒；

11、所述重组工程菌株是将seq id no.3所示的葡聚糖酶突变体编码基因连接表达载体ppic9k，并在毕赤酵母gs115中诱导表达所得。

12、本发明提供的技术方案之三，seq id no.4所示葡聚糖酶突变体的应用，特别地是在饲料行业中的应用，由于高稳定性葡聚糖酶突变体酶学特性适合动物肠胃消化条件，且稳定性提高，可以更好的应用于依靠纤维素酶添加剂的饲料中，增强动物对纤维素类饲料的吸收效率。

13、有益效果：

14、1.本发明提供了一种经诱变获得的葡聚糖酶突变体，该葡聚糖酶突变体，酶学特性稳定，热稳定性高，耐酸碱性好，不易变性失活，在饲料酶制剂行业具有广泛的应用前景。

15、2.本发明提供了一种发酵活力更高的葡聚糖酶突变体表达载体，葡聚糖酶液态生物发酵酶活达到50000u/ml以上。

16、3.本发明提供了一种的更适用饲料行业的葡聚糖酶突变体，最适反应温度35℃，最适ph 6.5，更符合动物消化系反应条件。

技术特征：

1.一种葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述葡聚糖酶突变体氨基酸序列如seq id no.4所示。

2.权利要求1所述葡聚糖酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.3所示。

4.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，采用的表达质粒为ppic9k。

6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主菌为毕赤酵母gs115。

7.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述葡聚糖酶突变体中的应用。

8.权利要求1所述葡聚糖酶突变体的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，是在饲料行业中的应用。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种高稳定性葡聚糖酶突变体及其应用。本发明利用N<supgt;+</supgt;离子注入诱变育种技术获得一株黑曲霉诱变株，通过基因工程技术获得一种热稳定性好、耐酸碱稳定性提升的葡聚糖酶突变体，所述突变体氨基酸序列SEQ ID No.4，并且通过转基因技术转入毕赤酵母GS115高效表达。所述葡聚糖酶突变体各项酶学特性适合动物肠胃消化条件，可以更好的应用于饲料行业。

技术研发人员：张辉,闫宜江,王克芬,刘金巍,佟新伟,郭庆文
受保护的技术使用者：山东隆科特酶制剂有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21