化橘红均一多糖及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及化橘红均一多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

1、中药多糖是多糖的重要组成部分。近年来随着细胞分子生物学和糖生物学的发展，学者发现中药多糖具有极其广泛的生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗辐射、抗衰老、降血糖、降血脂、抗炎、抗感染、调节肠道菌群、保肝镇痛等。中药多糖可通过多种方法制备，但提取纯化后的中药多糖仍然是复杂的混合体系，为方便后续结构表征及生物活性研究，提出“均一多糖”的概念。均一多糖是指总多糖经分离所得的相对分子质量单一且分布均匀的多糖片段。均一多糖相较总多糖，其组成更简单，性质更稳定。近年来中药均一多糖制备、结构解析、质量评价及控制和生物活性研究是多糖研究的新趋势。

2、化橘红(citri grandis exocarpium)为芸香科植物化州柚citrus grandis‘tomentosa’或柚citrus grandis(l.)osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。目前对于化橘红化学成分研究主要为黄酮类、挥发油类和香豆素类小分子化合物，对于其中糖类化合物尤其是多糖类成分研究甚少。而作为果实类来源的中药，其中含有丰富的多糖类物质，目前仅限于对化橘红多糖类成分的研究，但多糖分子量大、化学结构复杂，造成生物活性评价的不稳定，而均一多糖作为分子量分布集中的多糖片段，分子量小、化学结构相对简单，并且化学性质较稳定，制备过程可控，因此利于保证药效评价的稳定性和可靠性。但目前还没有关于化橘红均一多糖的研究报道，也没有关于化橘红均一多糖的活性研究报道。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种化橘红均一多糖及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供化橘红均一多糖的制备方法，包括如下步骤:

4、(1)将化橘红粉末经石油醚脱脂后，依次经热水浸提、初次醇沉、二次醇沉、沉淀复溶后用sevag法脱蛋白、脱色素得到化橘红粗多糖；

5、(2)化橘红粗多糖经阴离子交换层析串联葡聚糖排阻凝胶层析分离，得到化橘红均一多糖。

6、优选地，步骤(1)中，所述初次醇沉采用质量浓度为75-85％的乙醇，二次醇沉采用质量浓度为90-100％的乙醇。

7、优选地，步骤(1)中，sevag法脱蛋白采用的sevag试剂为氯仿:正丁醇体＝5:1v/v；脱蛋白后加入质量浓度为30％的过氧化氢溶液使其体积达15％，于60℃水浴静置脱色素。

8、优选地，步骤(2)中，所述阴离子交换层析采用deae-52纤维素层析柱，化橘红粗多糖上样后，依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.4mol/l的nacl溶液梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法实时监测，收集蒸馏水和0.4mol/l nacl溶液洗脱后的洗脱液，浓缩，分别得到cgepp-h2o和cgepp-0.4m多糖。

9、优选地，步骤(2)中，所述葡聚糖凝胶层析采用sephacryl-s-300hr丙烯葡聚糖凝胶层析柱，将cgepp-0.4m多糖上样后，以蒸馏水洗脱，洗脱液使用苯酚-硫酸法测定紫外吸光度值，以管号为横坐标吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线；并根据洗脱曲线合并洗脱峰部位，经减压浓缩、干燥，得到化橘红均一多糖cgehp-1和化橘红均一多糖cgehp-2。

10、sephacryl-s-300hr丙烯葡聚糖凝胶层析柱具有优异的分辨率和流动特性、高度物理和化学稳定性且易于操作。

11、第二方面，本发明提供一种化橘红均一多糖，由上述制备方法制备得到。

12、经分析鉴定，所述化橘红均一多糖cgehp-1的相对分子量为11310.56da，由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成；所述化橘红均一多糖cgehp-2的相对分子量为8112.34da，由单一甘露糖组成。

13、第三方面，本发明提供化橘红均一多糖在制备抗人源肝癌细胞药物中的应用。

14、本发明所述药物包括化橘红均一多糖及药学上可接受的辅料。所述药物可经本领域常规方法制备成适宜的剂型，优选地，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂或口服液。

15、本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：

16、(1)本发明首次从化橘红中提取分离得到化橘红均一多糖，并经药效学研究表明，化橘红均一多糖具有抑制肝癌细胞活性的作用，为开发制备抗人源肝癌细胞药物提供了新的思路；

17、(2)本发明制备工艺简单，可以快速获得均一多糖，适合于规模化生产。

技术特征：

1.一种化橘红均一多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的化橘红均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述初次醇沉采用质量浓度为75-85 %的乙醇，二次醇沉采用质量浓度为90-100 %的乙醇。

3.根据权利要求1所述的化橘红均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，sevag法脱蛋白采用的sevag试剂为氯仿:正丁醇体=5:1 v/v；脱蛋白后加入质量浓度为30%的过氧化氢溶液使其体积达15%，于60℃水浴静置脱色素。

4.根据权利要求1所述的化橘红均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述阴离子交换层析采用deae-52纤维素层析柱，化橘红粗多糖上样后，依次用蒸馏水、0.1、0.2、0.4 mol/l的nacl溶液梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法实时监测，收集蒸馏水和0.4 mol/l的nacl溶液洗脱后的洗脱液，浓缩，分别得到cgepp-h2o和cgepp-0.4m多糖。

5.根据权利要求4所述的化橘红均一多糖的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述葡聚糖排阻凝胶层析采用sephacryl-s-300hr丙烯葡聚糖凝胶层析柱，将cgepp-0.4m多糖上样后，以蒸馏水洗脱，洗脱液使用苯酚-硫酸法测定紫外吸光度值，以管号为横坐标吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线；并根据洗脱曲线合并洗脱峰部位，经减压浓缩、干燥，得到化橘红均一多糖cgehp-1和化橘红均一多糖cgehp-2。

6.一种化橘红均一多糖，由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到。

7.根据权利要求6所述的化橘红均一多糖，其特征在于，所述化橘红均一多糖cgehp-1的相对分子量为11310.56 da，由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成；所述化橘红均一多糖cgehp-2的相对分子量为8112.34da，由单一甘露糖组成。

8.权利要求6所述的化橘红均一多糖在制备抗人源肝癌细胞药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的化橘红均一多糖及药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂或口服液。

技术总结
本发明公开了一种化橘红均一多糖及其制备方法和应用，包括步骤：将化橘红粉末经石油醚脱脂后，依次经热水浸提、初次醇沉、二次醇沉、沉淀复溶后用Sevag法脱蛋白、脱色素得到化橘红粗多糖；化橘红粗多糖经阴离子交换层析串联葡聚糖排阻凝胶层析分离，得到化橘红均一多糖。本发明首次从化橘红中提取分离得到化橘红均一多糖，并经药效学研究表明，化橘红均一多糖具有抑制肝癌细胞活性的作用，为开发制备抗人源肝癌细胞药物提供了新的思路；本发明制备工艺简单，可以快速获得均一多糖，适合于规模化生产。

技术研发人员：肖凤霞,高泽林,詹若挺,钟嘉锐
受保护的技术使用者：广州中医药大学(广州中医药研究院)
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15