一种同时检测四种病毒的试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测，具体涉及一种同时检测四种病毒的试剂盒。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的一种致死率极高、传播速度极快的传染性疾病，患猪变现为食欲减退、高热、呼吸障碍、皮肤发绀，淋巴结、脾脏等免疫器官出现水肿症状。

2、猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，prv)引起的急性接触性传染病，prv可引起各年龄段猪发病，以引起呼吸困难、神经症状和繁殖障碍为特征，特别是导致母猪流产，对患病仔猪致死率可高达100％。

3、猪瘟(classical swine fever，csf)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus，csfv)引起的高度传染性病毒性疾病，其发病率和致死率达90％以上，猪是其唯一自然宿主。主要特征为高热稽留，血管形变造成广泛性出血、梗阻、坏死等变化。

4、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)引起的以母猪繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状为主要特征的一种高度接触性传染病。该病主要侵害母猪和1月龄仔猪，引起母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸障碍、败血症等状态。

5、目前，在规模化养猪场，通常会出现多种病毒共同感染的情况，而仅凭患病猪的临床症状，无法判定是由哪种或哪几种病毒感染引起。非洲猪瘟主要用elisa、ifa等血清学方法检测。而抗体产生需要一定的时间，血清学诊断方法不适于感染早期使用。20世纪90年代以来，我国对猪瘟病毒疫苗的大量使用，猪瘟常呈非典型的温和临床表征，且伴随长期的阴性带毒感染，临床上常借助反转录pcr(rt-pcr)方法检测。而常规rt-pcr检测方法在灵敏度、重复性和病毒含量测定等方面存在不足。猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合症存在一定相似点，如母猪流产，仔猪死亡率高，育肥猪生长迟缓、呼吸障碍，神经症状，免疫力下降等。单凭临床症状，无法区分患病类型，目前主要靠血清学和分子生物学进行诊断。

6、专利cn106957927a公开了一种非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用；专利cn106048094a猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及引物和探针；专利cn102586477猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒的rt-pcr检测及其专用引物；专利cn103627816a一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及其应用；现有的商品化的asfv、prv、csfv、prrsv检测试剂盒多为单项或双项rt-pcr，一个试剂盒一次试验仅能检测一种或两种病毒，对于可能混合感染了asfv、prv、csfv、prrsv的同份猪病料要确诊病原就需要3-4种试剂盒并且要做3-4次rt-pcr实验，不仅费时费力，检测成本也较高。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测四种病毒的试剂盒，提高检测的便利性和准确度。

2、本发明提供一种同时检测四种病毒的试剂盒，包括四对引物和探针，

3、检测非洲猪瘟病毒的引物对，即seq id no.1-2，探针为seq id no.3；

4、检测猪伪狂犬病毒的引物对，即seq id no.4-5，探针为seq id no.6；

5、检测猪瘟病毒的引物对，即seq id no.7-8，探针为seq id no.9；

6、检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对，即seq id no.10-11，探针为seqid no.12。

7、优选的，所述检测非洲猪瘟病毒的探针的5’端标记有fam报告荧光基团，3’端标记有sq1淬灭荧光基团。

8、优选的，所述检测猪伪狂犬病毒的探针的5’端标记有hex报告荧光基团，3’端标记有bhq1淬灭荧光基团。

9、优选的，所述检测猪瘟病毒的探针的5’端标记有rox报告荧光基团，3’端标记有bhq2淬灭荧光基团。

10、优选的，所述检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针的5’端标记有cy5报告荧光基团，3’端标记有bhq2淬灭荧光基团。

11、优选的，还包括pcr混合液，pcr混合液包括：2×probe rt-qpcr buffer:dntps、pcr buffer，rt-pcr enzyme mix:m-mlv酶、热启动taq酶，oligo mix:靶基因引物与探针，阴性对照，阳性对照。

12、具体的序列如表1所示。

13、表1序列表

14、 序号/seq id no. 序列 序号/seq id no. 序列 1 ctttgaagccacgggaggaata 7 gccgtagtggcgagctcc 2 ccagagcaagagaatttta 8 gaactactgacgactgtcctg 3 caacccagtggtcatattaacgt 9 tggtctaagtcctgagtaca 4 tggttgttgcgcacgtactcg 10 aggccgcargtacattc 5 cgtccgtgatctcctgcacg 11 ggacgccggacgacaaaygcgt 6 agacgcacttgccgcggcg 12 gcccctgcccaccacgttg

15、本发明的有益效果是，本发明的四重荧光pcr检测试剂，使用简单，不需要多种专业仪器，检测时间较短，检测效率较高，且不需要多人合作，节省劳动力。

16、本发明提供如下技术方案：一种非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光的pcr检测试剂，所述检测试剂包括一对非洲猪瘟病毒pcr特异性引物、一条特异性探针；一对猪伪狂犬病毒pcr特异性引物、一条特异性探针；一对猪瘟病毒pcr特异性引物、一条特异性探针；一对北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒pcr特异性引物和pcr混合液，所述检测试剂是以高度保守的非洲猪瘟病毒基因、猪伪狂犬病毒基因、猪瘟病毒基因和北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因为靶基因。

17、本发明针对非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型，提供了针对该四种病毒的多重pcr最佳反应体系和反应条件。本发明不需克隆、测序和序列比对，即可快速同时检测非洲猪瘟、猪伪狂犬病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征北美型病毒，特异性强、快速、准确，节约了检测成本和时间，解决了单重反应的局限性。