合成器和DNA合成方法及其应用

本申请涉及合成生物学，尤其是涉及合成器和dna合成方法及其应用。

背景技术：

1、随着当代信息技术的飞速发展，数据信息的含量呈指数级增长，这种增长趋势将很快超越现有存储介质的承受能力。脱氧核糖核酸(dna)是一种天然的信息存储介质，由于其对世界上几乎所有生物有机体的海量遗传信息具有超常的安全存储能力而受到人们的关注。作为已知高存储密度、高稳定性的数据存储介质，dna数据存储有下一代存储介质的潜力。

2、dna数据存储主要包括数据编码、数据写入(dna合成技术)、数据保存、数据索引、数据读取(dna测序技术)以及数据解码几个主要流程。针对于数据写入，常规的dna合成技术限制了写入速度和合成长度。以化学合成法中的亚磷酰胺法合成为例，该方法包括偶联、盖帽、氧化和脱保护的过程，相邻步骤间还有多次清洗步骤，导致dna合成的速度很慢，尽管其合成产量大但存在低通量的问题，难以应对大数据dna存储。

3、dna芯片的出现也衍生出了众多dna合成方法，如电化学合成法以及喷墨打印合成法，然而这些方法与上述方法的区别主要在于用电或用光脱保护，所以仍面临相同的问题。另有一种基于tdt(末端转移酶)酶法的dna合成方法，其支持3'端无模板依赖的dna合成，但延伸的长度在一次循环内不可控，单个循环流程较长，且无法形成阵列，无论在时间还是通量上，都限制了其应用于dna存储数据。

4、长片段的dna组装技术也可用于dna合成，典型的lcr(连接酶组装法)、pca(聚合酶组装法)、gold gate组装和gibson组装可以通过设计短片段寡肽核酸两边序列，一锅法按特定顺序拼接短片段核酸，但前提是需要利用固相合成技术合成大量的寡肽核酸，不仅耗时、成本高，而且拼接效率低，不能够实时进行数据的合成。

技术实现思路

1、本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种能够快速、高效、实时进行dna数据合成的合成器。

2、本申请的第一方面，提供用于在引物作用下扩增的核酸模板组，该核酸模板组包括n种模板，n≥2；第k种模板包括依次设置的：

3、5'端茎序列，5'端茎序列包括依次的第k目的序列和第k+1结合序列；

4、环序列，环序列包括第k聚合酶终止序列；

5、3'端茎序列，3'端茎序列包括依次的第k互补序列和第k结合区域序列；

6、第k种模板通过第k互补序列与所述5'端茎序列的反向互补结合形成茎环结构；

7、k选自1～n的整数；

8、其中，k<n时，第k种模板的第k+1结合序列与第k+1种模板的第k+1结合区域序列反向互补；k＝n时，第k种模板的第k+1结合序列与第1种模板的第1结合区域序列反向互补；

9、k＝1时，第k种模板的第k结合区域序列用于杂交引物。

10、在本申请的一些实施方式中，核酸模板组还包括载体，第k种模板的第k结合区域序列的下游还包括连接序列，模板通过连接序列固定于载体上。

11、在本申请的一些实施方式中，载体为固相载体。

12、在本申请的一些实施方式中，固相载体包括磁珠。

13、在本申请的一些实施方式中，连接序列包括聚合碱基序列。

14、在本申请的一些实施方式中，聚合碱基序列的长度为1～100nt。

15、在本申请的一些实施方式中，聚合碱基序列的碱基任选自a、c或t。

16、在本申请的一些实施方式中，不同种模板具有相同的目的序列。

17、在本申请的一些实施方式中，不同种模板具有不同的目的序列。

18、在本申请的一些实施方式中，目的序列的长度为1～1000nt。

19、根据本申请实施例的核酸模板组，至少具有如下有益效果：

20、核酸模板组中核酸模板的序列结构为全新设计，其中存在下一步合成反应的互补配对的结合序列和结合区域序列，这些互补配对的组合方式一般为分两种或更多，用于交替回合进行反应，并且在经历每一次合成后，核酸模板不会发生损失并可快速进入下一轮的合成流程。通过这种方式，延伸的长度可控，并且单个循环的流程较短，可以实现高通量的合成，并且在合成前无需合成大量的寡肽核酸，速度快、成本低，能够适用于实时进行数据的合成。

21、本申请的第二方面，提供一种合成器，该合成器包括微流控芯片，微流控芯片包括存储室，存储室容纳有前述的核酸模板组。

22、在本申请的一些实施方式中，合成器包括：

23、存储单元，存储单元包括存储室，存储室容纳有前述的核酸模板组；

24、合成单元，合成单元包括反应室；

25、其中，核酸模板组能够被驱动进入反应室参与合成反应。

26、在本申请的一些实施方式中，核酸模板组通过压力、电润湿、表面波、静电力、磁力、离心力中的至少一种方式被驱动进入反应室。

27、本申请的第三方面，还提供一种dna合成方法，该dna合成方法包括以下步骤：取前述的核酸模板组，与引物、dntp、聚合酶、解旋酶混合反应。

28、在本申请的一些实施方式中，引物的终浓度为1～100mm。

29、在本申请的一些实施方式中，聚合酶的终浓度为0.1～10单位/μl。

30、在本申请的一些实施方式中，解旋酶的终浓度为0.1～10单位/μl。

31、在本申请的一些实施方式中，反应缓冲液的体积为10～50μl。

32、在本申请的一些实施方式中，反应缓冲液中包括mg2+、k+等，以及表面活性剂等成分。

33、在本申请的一些实施方式中，引物的浓度为1～100mm，反应缓冲液的体积为10～50μl。

34、本申请的第四方面提供前述的核酸模板组，或前述的合成器在dna数据存储中的应用。

35、在本申请的一些实施方式中，dna数据存储包括dna合成、dna保存、dna索引、dna测序、dna解码等其中至少一种。

36、本申请中针对现有技术的不足，设计了一种用于dna数据存储的实时合成器，其优点在于速度快、成本低、通量高，设备小。合成基元可重复参加反应减少合成成本，通过设计高通量微流控芯片可实现并行合成，提高信息合成速度。此外，现有技术中可能需要根据上一次合成后的产物末端序列重新合成下一个模板，然后再来进行下一步的合成反应从而达到对任意文本的合成，但在本申请实施例的技术方案中，仅需设计若干个不同的核酸模板即可完成对任意文本进行合成，更为方便高效。

37、本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

技术特征：

1.用于在引物作用下扩增的核酸模板组，其特征在于，所述核酸模板组包括n种模板，n≥2；第k种模板包括依次设置的：

2.根据权利要求1所述的核酸模板组，其特征在于，所述核酸模板组还包括载体，第k种模板的所述第k结合区域序列的下游还包括连接序列，模板通过所述连接序列固定于所述载体上；

3.根据权利要求2所述的核酸模板组，其特征在于，所述连接序列包括聚合碱基序列；

4.根据权利要求1至3任一项所述的核酸模板组，其特征在于，不同种模板具有相同的目的序列，或，不同种模板具有不同的目的序列；

5.合成器，其特征在于，包括微流控芯片，所述微流控芯片包括存储室，所述存储室容纳有权利要求1至4任一项所述的核酸模板组。

6.根据权利要求5所述的合成器，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的合成器，其特征在于，所述核酸模板组通过压力、电润湿、表面波、静电力、磁力、离心力中的至少一种方式被驱动进入所述反应室。

8.dna合成方法，其特征在于，包括以下步骤：取权利要求1至4任一项所述的核酸模板组，与引物、dntp、聚合酶、解旋酶混合反应。

9.根据权利要求8所述的dna合成方法，其特征在于，所述引物的终浓度为1～100mm，和/或，所述聚合酶的终浓度为0.1～10单位/μl，和/或，所述解旋酶的终浓度为0.1～10单位/μl。

10.权利要求1至5任一项所述的核酸模板组、权利要求5至8任一项所述的合成器在dna数据存储中的应用。

技术总结
本申请公开了合成器和DNA合成方法及其应用，本申请的第一方面，提供用于在引物作用下扩增的核酸模板组，该核酸模板组包括模板，模板包括依次设置的5'端茎序列、环序列和3'端茎序列。核酸模板组中核酸模板的序列结构为全新设计，其中存在下一步合成反应的互补配对的结合序列和结合区域序列，这些互补配对的组合方式一般为分两种或更多，用于交替回合进行反应，并且在经历每一次合成后，核酸模板不会发生损失并可快速进入下一轮的合成流程。通过这种方式，延伸的长度可控，并且单个循环的流程较短，可以实现高通量的合成，并且在合成前无需合成大量的寡肽核酸，速度快、成本低，能够适用于实时进行数据的合成。

技术研发人员：蒋兴宇,李健恺
受保护的技术使用者：南方科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8