副干酪乳酪杆菌IOB413后生元粉活性成分的制备方法及应用与流程

本发明涉及微生物，尤其是副干酪乳酪杆菌（ lacticaseibacillus  paracasei）iob413后生元粉活性成分的制备和分离方法，以及其在抗幽门螺杆菌方面的用途。

背景技术：

1、幽门螺旋杆菌作为人类的i类致癌因子，与消化道溃疡、慢性胃炎、胃黏膜相关淋巴组织淋巴癌和胃癌等人类常见疾病紧密相关。根据2020年相关报道，幽门螺旋杆菌全球自然人群感染率超过50%，我国平均感染率为59%，儿童平均感染率为40%，其中，约10-15%的感染者可发展为消化性溃疡，约5%可发展为胃黏膜萎缩，小于1%感染者可发展为胃癌，因此幽门螺旋杆菌目前依然是我国人民生命健康的重要威胁。

2、幽门螺旋杆菌的治疗方法主要有四联抗生素疗法和三联抗生素疗法。四联抗生素疗法一般两周14天为一疗程，疗程结束后一周内复查，或一个月后复查。三联疗法即使用奥美拉唑、阿莫西林和克林霉素，三种药物的用量需遵医嘱，且按时按量服用。但抗生素的大量使用会导致幽门螺旋杆菌整体耐药性上升，愈后再感染率升高，而且抗生素的大量服用会导致人体正常菌落失衡，多会出现呕吐、恶心、食欲不振等不良反应，甚至引起其它肠胃疾病的发生。

3、因此，寻找预防治疗幽门螺旋杆菌感染的新方法势在必行，而益生菌和益生菌产品以其温和、安全、高效等特性已成为目前替代抗生素疗法的一种有效途径和选择。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的制备和分离方法，制备得到的活性成分产品以及用途。

2、本发明使用的副干酪乳酪杆菌iob413（ lacticaseibacillus paracasei）分离自天然发酵酸面团中，于 2018 年 6 月 29 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，其保藏编号为cgmccno.16022。

3、此菌株已经进行了菌株保藏和理化指标的检测，于2021年3月19日在中国食品发酵工业研究院有限公司进行了细菌鉴定检测，菌落为白色、圆形、表面湿润、不透明，边缘整齐的菌落。

4、本发明的技术方案如下：

5、本发明提供一种副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的制备和分离方法，依据该方法所得到的活性成分产品，以及其在制备抗幽门相关药物中的应用。

6、第一方面，本发明提供一种副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的制备和分离方法，具体步骤为：

7、（1）副干酪乳酪杆菌iob413的培养和发酵后生元粉的制备；

8、（2）发酵后生元粉活性成分的大孔吸附层析法和阳离子交换法分离；

9、（3）发酵后生元粉活性成分的活性验证；

10、（4）发酵后生元粉活性成分的理化性质分析。

11、优选地，步骤（1）包括：菌种活化和发酵培养，种子的最佳种龄为20-24h，料水比为1：1.5，接种量为5×107cfu/ml，发酵时间为32h。

12、优选地，步骤（1）包括：干燥及粉碎，干燥温度在55-60℃，粉碎温度-100℃，主机转速50hz，风机38hz，进料速度15hz，出料25hz，粉末细度300目到500目。

13、优选地，步骤（2）中，大孔吸附层析法分离活性物质的操作步骤为：

14、a.xad-16n大孔吸附树脂预处理；

15、b.柱子平衡预处理；

16、c.将经低温粉碎后的iob413后生元成品与纯净水按1：3混匀，离心取上清液，以4ml/min的流速流过xad-16n大孔吸附树脂，去除未吸附的上清液，再依次用2倍柱体积的10%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇，以2ml/min的流速洗脱大孔树脂上吸附的物质，并收集各梯度的洗脱液。

17、优选地，步骤（2）中使用2倍柱体积的20%的乙醇进行洗脱。

18、优选地，步骤（2）中，阳离子交换法分离活性物质的操作步骤为：

19、d.从xad-16n大孔吸附树脂中粗分离获得洗脱液；

20、e.将阳离子交换填料ski-20（粒径50-75µm）预处理后进行湿法装柱并清洗；

21、f.缓冲液(20mm醋酸钠，ph4.0)继续冲大约3-5个柱体积来平衡层析柱；

22、g.平衡后上样品，用缓冲液冲洗掉柱子上未结合杂蛋白，然后用不同梯度的洗脱液进行洗脱：20mm醋酸钠+0.2m氯化钠、20mm醋酸钠+0.5m氯化钠、20mm醋酸钠+1.0m氯化钠，收集各梯度的洗脱液。

23、优选地，步骤（2）中使用20mm醋酸钠+0.2m氯化钠进行洗脱。

24、优选地，步骤（3）包括副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的预处理：按0.5g/份，称取8份经低温粉碎后的iob413后生元粉，分别加入甲醇、乙醇、乙腈、水、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、三氯甲烷各1ml，混和超声5min，5000g/min离心5分钟。

25、优选地，步骤（3）包括副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的初步活性检测，采用滤纸片法进行活性测定大孔吸附层析法洗脱液和阳离子交换法洗脱液，以藤黄八叠球菌作为指示菌。

26、优选地，步骤（3）包括副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的hplc分析：大孔吸附层析20%乙醇洗脱液和阳离子交换层析20mm醋酸钠+0.2m氯化钠洗脱液经预处理后置于4℃待用，用流动相a（100%乙腈+0.05%tfa）平衡c18反相色谱柱1小时，直至基线走平。

27、优选地，步骤（4）包括副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的热稳定性进行探究：在50℃水浴预处理后，用60℃、70℃、80℃、100℃分别水浴处理10min，等冷却至室温，以藤黄八叠球菌作为指示菌。

28、优选地，步骤（4）包括副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的对酸碱的耐受性探究：4.0到9.0的各种ph值，上清液与各梯度ph液混合，然后用1m naoh或1m hcl调节ph值至5.0，以藤黄八叠球菌作为指示菌。

29、优选地，步骤（4）包括副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的酶解敏感性探究：用1mg/ml的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶k、和α-糜蛋白酶处理活性成份，以藤黄八叠球菌作为指示菌。

30、优选地，步骤（4）包括抗菌谱分析，参考2019年7月1日实施的中华人民共和国卫生行业标准《抗菌和抑菌效果评价方法》，针对引起肠道疾病的5种常见致病菌以及肠道中的正常菌群，进行了副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的抗菌谱分析

31、第二方面，本发明提供一种根据副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的制备和分离方法得到的生物发酵产品。

32、第三方面，本发明提供上述根据副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的制备和分离方法得到的生物发酵产品，在制备抗幽门螺旋杆菌感染相关药物中的应用。

33、有益效果：

34、（1）本发明提供副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性物质的的制备和分离方法，通过实验条件摸索和控制，得到最佳的活性物质制备发酵条件：料水比为1：1.5，接种量为5×107cfu/ml，发酵时间为32h。并使用大孔吸附层析法和阳离子交换法成功实现了活性物质的分离纯化，验证了活性物质的抑菌活性，因此，上述副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性物质的的制备和分离方法是高效且有力的活性物质取得方式，对于领域内该活性物质的分离和提取以及后续应用具有巨大的技术贡献。

35、（2）依据该方法所得到副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性物质，对幽门螺旋杆菌以及肠炎沙门氏菌等具有较好的抑制和杀灭效果，但在一定使用剂量下对肠道中的正常菌群或益生菌（如：枯草芽孢杆菌、链球菌、乳酸菌等）则无明显影响，实现了“选择性”抑菌治疗，对幽门螺旋杆菌感染临床治疗的有效性和针对性显著提高。

36、（3）依据该方法所得到副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性物质对蛋白酶敏感，易被蛋白酶所降解，因此服用后，流经肠胃时，易被肠胃中的胃蛋白酶、糜蛋白酶以及胰蛋白酶所降解，不易形成残留，因此不易对人体产生副作用也不会对环境造成不利影响。另外该活性产物热稳定性好，且耐酸碱、有机溶剂等不利因素，因此利于产品的储存运输，具有货架期长，储存条件宽松等优点，具有较大的商业开发和生产应用价值。