一种微生物检测背景菌阈值设定方法及其应用与流程

本申请属于分子生物学检测领域，具体地，本申请提供了一种微生物检测背景菌阈值设定方法及其应用。

背景技术：

1、基于宏基因组测序（mngs）的病原微生物检测技术是通过对临床样本的 dna 或rna 进行鸟枪 (shotgun) 法测序，可以无偏倚地检测多种病原微生物 (病毒/细菌/真菌/寄生虫) 的一种技术。宏基因组测序检测病原微生物得步骤涉及样本采集、样本处理、样本测序和数据分析等。从样本到分析中间可能引入来自试剂、耗材或环境来源的其他微生物信息。

2、病原微生物检测需要在最后的数据分析结果中有效区分真正来源样本的微生物和疑似流程背景微生物，提供临床有参考价值的分析结果。来源于流程和环境的部分微生物属于机会致病，通过物种名称直接从结果中排除或在分析微生物组成之前去除背景菌基因组数据会影响检测结果的准确性。病原微生物检测步骤虽然相似，但使用的试剂，耗材和实验流程没有统一的标准，即实验室之间存在差异，其背景微生物也存在差异，需按照实际情况定制校准。

3、现有技术的解决方法包括对检测中高频出现微生物/常见的微生物进行标记，建立背景微生物物种谱，在检测结果中过滤物种谱中的微生物。环境/试剂中存在的部分微生物例如大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌，物种序列数稳定但同时是致病微生物，通过一刀切的方法对对应微生物进行标记去除会降低真实检出灵敏度。现有技术的解决方法还可以是是构建一大批阴性/环境质控，对高频出现的微生物进行标记，建立背景微生物物种谱，在检测结果中过滤物种谱或设定固定阈值判定是否为背景；针对不同的实验室和不同样本类型，前处理和检测实验方法不同，单一的阴性质控或环境质控样品类型单一，把不同方法得到的数据整理在一起设定统一的背景阈值来判定检出菌阴性或者阳性会放大实验技术偏差的影响，增加检测方法的假阴性。

技术实现思路

1、为了解决上述问题。一方面，本申请提供了一种微生物检测背景菌阈值设定方法，所述方法包括以下步骤：

2、s1.检测分组；

3、s2.阴性测试：利用样本按照s1的检测分组分别进行测试；

4、s3.阳性测试：在样本中添加已知微生物，按照s1的检测分组再次分别进行测试；

5、s4.极值计算：在s2和s3的测试结果中除去s2中添加的微生物的测试数据，其他微生物测试数据均一化之后计算在微生物在各分组中的极大值作为微生物检测背景菌阈值。

6、进一步地，s1步骤中将样本按照样本类型以及对应的测试试剂和测试方法来分组。

7、所述样本类型包括但不限于：人或动物的样本，如肺泡灌洗液、血液、脑脊液、痰液、胸腔积液等；环境样本，如水、土壤等。

8、进一步地，s2步骤中利用相同的培养液，分别按照分组进行多条件模拟测试全流程，不考虑背景菌，得到阴性样本微生物组成谱。

9、进一步地，s3步骤中利用相同的培养液，添加已知微生物物种进行混合，分别按照分组进行多条件模拟测试，不考虑背景菌，得到阳性样本微生物组成谱。

10、进一步地，步骤s2和/或s3中使用无菌培养的人细胞进行测试，或者使用阳性和/或阴性的临床样本进行测试。

11、进一步地，所述s4步骤中从s3得到的阳性样本微生物组成谱去除其中已知微生物物种与s2得到的阴性样本微生物组成谱，获得质控背景微生物谱，利用统计学方法计算微生物极大值，步骤包括：

12、（a）对每次实际测序数据量x，将检出背景微生物reads数 ri按照微生物逐一均一化为数据量c下的reads数 ni：

13、

14、（b）将均一化后的每次检测微生物谱，按照样本类型以及对应的测试试剂和测试方法的分组进行合并；

15、（c）对合并后的微生物谱按照物种分别计算质控背景微生物谱中微生物的25%分位数 q1和75%分位数 q3；

16、（d）极大值 mi=  q3+1.5×( q3- q1)。

17、其中c为常数，例如c可以为1m-20m之间取值，例如c为1m、10m或20m等。

18、进一步地，所述方法中还包括s5.应用阈值进行判断的步骤。

19、进一步地，s5步骤中判定微生物是背景菌还是检出菌采用的是e值，其中e值为判定该微生物是背景菌还是检出菌的判定值，其计算方法为： ei= ni/( ni+ mi)。

20、其中 m i 、n i 和e i分别表示对不同微生物（以下标i表示）进行检测时得到的极大值 m，均一化的reads数 n以及经上述公式计算得出的 e值。

21、可以理解的是， e值越大（接近1，即m越接近0）检出的微生物越趋近于检出菌，越小（接近0.5）越趋近于背景菌。

22、e值的计算不限于上述方法，基于比值变化的各种计算方法均可使用。

23、另一方面，本申请提供了上述方法用于宏基因组检测微生物的检测背景菌阈值设定。

24、进一步地，所述微生物为病原菌。

25、上述方法的有益效果在于：

26、微生物检测结果中，dna检测与rna检测的实验方法和试剂不相同，血液标本一般采样细胞游离dna进行dna检测，脑脊液样本中人细胞数相对血液和肺泡灌洗液中的人细胞数更低，即对应提取的样品核酸浓度和占比均不相同，按照这种组合方式能最大程度上还原真实检测中的背景微生物；

27、无菌培养人细胞制备参考品能最大程度控制其中非实验本身的微生物，可灵活调控宿主细胞投入量；

28、利用均一化的微生物检测值进行极值计算可消除测序数据量差异；

29、利用分位数 q3+1.5×( q3- q1)计算极大值可以避免检测数据随机性不服从正态分布导致的差异。

技术特征：

1.一种微生物检测背景菌阈值设定方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中s1步骤中将样本按照样本类型以及对应的测试试剂和测试方法来分组。

3.根据权利要求2所述的方法，其中s2步骤中利用相同的培养液，分别按照分组进行多条件模拟测试全流程，不考虑背景菌，得到阴性样本微生物组成谱。

4.根据权利要求3所述的方法，其中s3步骤中利用相同的培养液，添加已知微生物物种进行混合，分别按照分组进行多条件模拟测试，不考虑背景菌，得到阳性样本微生物组成谱。

5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤s2和/或s3中使用无菌培养的人细胞进行测试，或者使用阳性和/或阴性的临床样本进行测试。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法中还包括s5.应用阈值进行判定的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中s5步骤中判定微生物是背景菌还是检出菌采用的是e值，其中e值为判定该微生物是背景菌还是检出菌的判定值，其计算方法为：ei=ni/(ni+mi)。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法在宏基因组检测微生物的背景菌阈值设定中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述微生物为病原菌。

技术总结
本申请提供了一种微生物检测背景菌阈值设定方法及其应用，所述方法包括：S1.检测分组；S2.阴性测试：利用样本按照S1的检测分组分别进行测试；S3.阳性测试：在样本中添加已知微生物，按照S1的检测分组再次分别进行测试；S4.极值计算：在S2和S3的测试结果中除去S2中添加的微生物的测试数据，其他微生物测试数据均一化之后计算在微生物在各分组中的极大值作为微生物检测背景菌阈值。本申请的方法可以最大程度地还原真实检测中的背景微生物并消除数据差异。

技术研发人员：周袁杰,李少川
受保护的技术使用者：瑞因迈拓科技（广州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16