一种ω-转氨酶突变体及其编码基因与应用

文档序号:37174318发布日期:2024-03-01 12:24阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,将如seq id no.3所示的氨基酸序列的第290位,第292位,第163位,第130位,第144位,第142位,第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得。

2.如权利要求1所述的一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,将如seq id no.3所示的氨基酸序列进行下列之一或其中两种以上的组合突变后获得:(1)第290位苏氨酸突变为丝氨酸;(2)第292位丙氨酸突变为甘氨酸;(3)第163位亮氨酸突变为异亮氨酸;(4)第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸;(5)第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸;(6)第142为苏氨酸突变为色氨酸;(7)第101位赖氨酸突变为精氨酸;(8)第130位缬氨酸突变为组氨酸;(9)第140位丝氨酸突变为精氨酸。

3.如权利要求1或2所述的一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,其氨基酸序列如seq idno.8或seq id no.9或seq id no.10或seq id no.5所示。

4.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,其氨基酸序列如seq idno.8所示,其构建方法包括以下步骤:将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位,与(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如seq id no.3所示的ω-转氨酶嵌合体,将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸,第292位丙氨酸突变为甘氨酸,第163位亮氨酸突变为异亮氨酸,其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.1所示,所述(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列如seqid no.7所示。

5.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,其氨基酸序列如seq idno.9所示,其构建方法包括以下步骤:将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位,与(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如seq id no.3所示的ω-转氨酶嵌合体,将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸,第292位丙氨酸突变为甘氨酸,第163位亮氨酸突变为异亮氨酸,第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸,其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.1所示,所述(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.7所示。

6.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,其氨基酸序列如seq idno.10所示,其构建方法包括以下步骤:将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位,与(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如seq id no.3所示的ω-转氨酶嵌合体,将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸,第292位丙氨酸突变为甘氨酸,第163位亮氨酸突变为异亮氨酸,第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸,第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸,第142为苏氨酸突变为色氨酸,第101位赖氨酸突变为精氨酸,其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.1所示,所述(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.7所示。

7.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,其氨基酸序列如seq idno.5所示,其构建方法包括以下步骤:将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位,与(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如seq id no.3所示的ω-转氨酶嵌合体,将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸,第292位丙氨酸突变为甘氨酸,第163位亮氨酸突变为异亮氨酸,第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸,第142为苏氨酸突变为色氨酸,第101位赖氨酸突变为精氨酸,第130位缬氨酸突变为组氨酸,第140位丝氨酸突变为精氨酸,其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.1所示,所述(r)-ω-转氨酶的氨基酸序列如seq id no.7所示。

8.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体,其特征在于,其氨基酸序列如seq idno.5所示,其编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

9.一种含有编码如权利要求1~8中任意一项所述的ω-转氨酶突变体的基因的重组载体或基因工程菌。

10.权利要求1~8中任意一项所述的ω-转氨酶突变体在微生物催化前西他列汀酮不对称合成西他列汀中间体中的应用。


技术总结
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种ω‑转氨酶突变体及其编码基因与应用。本发明构建的ω‑转氨酶嵌合体MwTA<subgt;Mc</subgt;对底物前西他列汀酮第一次出现催化活性,且表现出严格的(R)‑立体选择性。针对MwTA<subgt;Mc</subgt;的酶活改造,获得一系列优势突变菌株。突变体MwTA<subgt;M3</subgt;、MwTA<subgt;M4</subgt;、MwTA<subgt;M7</subgt;和MwTA<subgt;M8</subgt;的比细胞活力较过表达嵌合体的菌株MwTA<subgt;Mc</subgt;分别提高了11.28倍、20.33倍、42.33倍和278.48倍。其中,嵌合体和突变体催化2g/L前西他列汀酮时,底物转化率由MwTA<subgt;Mc</subgt;的4.5%提高到MwTA<subgt;M4</subgt;的30.3%,以及MwTA<subgt;M8</subgt;的95.6%。最佳优势突变体MwTA<subgt;M8</subgt;基本实现了2g/L前西他列汀酮的全转化,具有一定的应用前景。

技术研发人员:柳志强,朱芳莹,张晓健,黄梦钰,郑垦,郑裕国
受保护的技术使用者:浙江工业大学
技术研发日:
技术公布日:2024/2/29
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