小分子激活的分子内催化发夹自组装系统及其制备方法与应用

本发明属于生物传感器领域，具体涉及小分子激活的分子内催化发夹自组装系统及其制备方法与应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、卡那霉素(kana)是一种光谱氨基糖苷类卡那霉素，能被用作治疗动物细菌感染的兽药，但是卡那霉素的滥用不可避免地导致其在动物源性食品中的残留，进而通过食物链在人体内积累，威胁人类健康。为了避免危害，各种机构都规定了特定食品中卡那霉素的残留限量。因此，高效和灵敏地检测食品中卡那霉素残留对食品安全和人类健康具有重要意义。

3、卡那霉素检测的常用方法主要包括色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(elisa)等。然而，这些方法常受限于其自身的缺陷，包括严格的样品预处理、需要专业人员、易受损的抗体等。另外，基于适体的生物传感器(即，适体传感器)已被开发用于卡那霉素测定。在卡那霉素的适体传感器中，适体是一种具有高稳定性的功能核酸，能特异性地结合卡那霉素并发生构象变化，从而将卡那霉素输入转化为可检测的输出信号。然而，适体传感器对卡那霉素的直接响应常导致其分析灵敏度较差。为提高卡那霉素适体传感器的灵敏度，dna信号扩增方法已被引入，包括酶辅助的和无酶的扩增方法。其中，由于其无酶和等温的特点，无酶的扩增方法已吸引了人们的关注。作为一种典型的无酶扩增方法，催化发夹自组装(cha)已被引入到卡那霉素的适体传感器中，用于卡那霉素的检测。在基于cha的卡那霉素适体传感器中，当适体与目标物结合之后，释放的引物能够触发游离发夹的交叉杂交，产生大量的双链dna产物和扩增的输出信号。然而，传统的cha反应依赖于游离发夹的随机碰撞，导致卡那霉素-引发的信号扩增的速度和效率较低。

4、通过将发夹绑定到dna框架上，分子内cha(intracha)已被开发成一种新型cha。由于dna框架的空间约束作用，intracha中发夹的碰撞频率增加，从而提高了信号扩增的速度和效率。intracha已经被核酸、蛋白质、和酶成功激活。然而，由小分子如卡那霉素激活的intracha鲜有报道。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种小分子激活的分子内催化发夹自组装(sm-intracha)系统及其制备方法与应用，本发明的sm-intracha系统可被卡那霉素成功激活，且采用sm-intracha系统对kana输入显示出提高的信号放大效率，得到令人满意的灵敏度，检出限低至0.019ng/ml。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、本发明的第一方面，提供一种小分子激活的分子内催化发夹自组装(sm-intracha)系统，包括intracha探针和双链dna探针；

4、所述双链dna探针由aptp链和inh链杂交而成，所述aptp链的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述inh链的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、所述intracha探针包括dna四面体，所述dna四面体的两个顶点上分别连接有发夹探针h1、发夹探针h2；所述发夹探针h1的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述发夹探针h2的核苷酸序列如seq id no.4所示。

6、本发明所提供的sm-intracha系统包含两个关键元素：用于kana识别和信号转导的双链aptp/inh探针和用于信号放大的intracha探针，且发夹探针h2的颈部标记有荧光团cy5和猝灭团bhq2。在双链aptp/inh探针中，抗生素适体和intracha引物均被抑制链(即inh链)部分封闭，以避免信号意外泄漏。在kana存在的情况下，双链aptp/inh探针中的适体序列可以特异性结合kana并发生构象变化，导致inh链解离，暴露出引物序列。随后，暴露出的引物可以高效触发intracha探针中的h1与h2发生杂交，使发夹探针h2中的荧光团cy5和猝灭团bhq2，荧光团cy5荧光恢复。因此，可以通过检测荧光团cy5的荧光强度来检测kana的浓度。

7、经验证，与传统cha系统相比，该sm-intracha系统对kana输入显示出提高的信号放大效率，得到令人满意的灵敏度，检出限低至0.019ng/ml。另外，sm-intracha系统能够从其他抗生素中选择性地识别出kana。sm-intracha系统为食品安全领域开发抗生素检测的高效、无酶信号扩增平台提供了新的途径。

8、在本发明的一些实施例中，所述小分子为抗生素，优选为卡那霉素。现有报道中intracha已经被核酸、蛋白质、和酶成功激活。然而，由小分子激活的intracha鲜有报道。本发明首次提供了一种由卡那霉素激活的sm-intracha系统，实现了小分子激活intracha，拓展了intracha的研究。

9、在本发明的一些实施例中，所述dna四面体由四条单链dna组装而成，所述四条单链dna的核苷酸序列如seq id no.5-8所示。本发明还可采用其他与上述dna四面体的棱长相同的dna四面体，这是因为dna四面体的棱长如果过长，导致其顶点连接的两个发夹探针之间的距离过大而不能进行发夹探针间的组装反应。

10、本发明的第二个方面，提供一种上述的小分子激活的分子内催化发夹自组装系统的制备方法，包括以下步骤：

11、1)制备双链dna探针：将aptp链和inh链以1:3～5的摩尔比混合，90～100℃加热8～12min，冷却至23～27℃，即得；

12、2)制备intracha探针：将四条单链dna进行等摩尔量混合，并在75 85℃下孵育1-3min，然后在55-65℃孵育1-3min，最后在3-5℃下保存；将发夹探针h1、发夹探针h2分别在85-95℃孵育3-8min，自然冷却至20-30℃；将等摩尔量的发夹探针h1、发夹探针h2和dna四面体混合，20-30℃孵育0.5-1.5h，即得。

13、在本发明的一些实施例中，步骤1)-步骤2)的过程，均在pbs缓冲溶液中进行。

14、与传统cha系统相比，该sm-intracha系统对kana输入显示出提高的信号放大效率，得到令人满意的灵敏度，检出限低至0.019ng/ml。且该sm-intracha系统能够从其他抗生素中选择性地识别出kana。因此，本发明的第三个方面，提供一种上述的小分子激活的分子内催化发夹自组装系统在检测卡那霉素中的应用。

15、本发明的第四个方面，提供一种卡那霉素的检测方法，包括如下步骤：

16、(1)构建上述的小分子激活的分子内催化发夹自组装系统；

17、(2)将待检测样本、小分子激活的分子内催化发夹自组装系统共同孵育；

18、(3)进行荧光光谱测量。

19、在本发明的一些实施例中，所述共同孵育为37℃下孵育40-80min，优选为60min。

20、在本发明的一些实施例中，所述荧光光谱测量为：在635nm波长的激发光下，检测在670nm处荧光强度。

21、在本发明的一些实施例中，共同孵育时，intracha探针和双链dna探针的浓度比为1～5：1～5，优选为2：1。

22、本发明的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：

23、本发明提供了一种用于检测抗生素的小分子激活的分子内催化发夹自组装(sm-intracha)系统，其能够提高信号扩增的效率。该sm-intracha系统包含用于抗生素识别和信号转导的双链dna探针，以及用于信号扩增的intracha探针。其中，在双链dna探针中，抗生素适体序列和intracha引物序列都被抑制链部分封闭，以避免信号意外泄漏。另外，在intracha探针中，两个发夹被同时固定在dna四面体上，以减少俩发夹之间的距离并增加发夹的局部浓度。卡那霉素(kana)被选作模型抗生素。向系统中加入抗生素kana后，双链dna探针通过适体构象变化来识别kana，从而暴露出引物来诱导intracha探针发生信号扩增反应。与传统cha系统相比，sm-intracha系统对kana输入显示出提高的信号放大效率，得到令人满意的灵敏度，检出限低至0.019ng/ml。另外，sm-intracha系统能够从其他抗生素中选择性地识别出kana。并且，sm-intracha系统能够在加标牛奶样品中精确检测kana。sm-intracha系统为食品安全领域开发抗生素检测的高效、无酶信号扩增平台提供了新的途径。