一种基于CRISPR-Cas12a的嗜水气单胞菌显色可视化检测试剂、方法及应用

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种基于pcr结合crispr-cas12a方法的嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)显色可视化检测试剂，及试剂盒、应用、检测装置和检测方法。

背景技术：

1、嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)广泛存在于世界各地的水体以及患病鱼类、食品和动物粪便中，是重要的水生和人畜共患病原体，可引起水产养殖动物败血症等疾病，导致养殖鱼类大规模死亡，给水产养殖业带来巨大经济损失。嗜水气单胞菌感染人类可导致胆膜炎、急性肠胃炎等感染性疾病，对水产品质量安全以及人类健康构成威胁。因此，病原体的早期检测对于预防和控制这些感染尤为重要。

2、现有技术中针对嗜水气单胞菌的检测方法有许多种，例如，carnahan等采用传统的病原菌培养与生化鉴定技术对60株临床分离菌鉴定准确率达97％(58/60)，对18株atcc气单胞菌准确率为100％，该方法虽然准确但耗时耗力，而且需要专业技术人员，无法满足现场快速检测的需求。斑点印迹法、单克隆抗体等免疫学检测方法虽然节省了时间，但抗体制备以及商业化免疫测试盒的成本较高，不易在养殖场普及。多重pcr、实时荧光pcr以及基因测序、生物传感器等新兴技术需要价格高昂的专业设备以及受培训过的专业技术人员，均不适合在资源有限的实验室或现场应用。

3、因此，目前亟需建立一种便携式、低成本、灵敏度高的适合现场快速检测嗜水气单胞菌的有效方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明旨在提供一种基于pcr结合crispr-cas12a方法的嗜水气单胞菌显色可视法检测试剂、试剂盒及显色可视检测方法，该试剂及方法操作简单、快速、准确、灵敏度高。

2、一方面，本技术提供了一种基于pcr结合crispr-cas12a方法的嗜水气单胞菌显色可视化检测试剂，所述试剂包括：

3、用于pcr特异性扩增嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)气溶素aera基因(seq id no：1)的引物对，所述引物对的序列如下：

4、上游引物1-fw：5’-catagggataggagatgtcagccttgtagagc

5、(seq id no：2)-3’，

6、下游引物1-rv：5’-tgagcgagaaggtgaccaccaagaaca(seq id no：3)-3’；

7、用于引导crispr-cas12a特异性识别切割所述气溶素aera基因的grna，所述grna的序列如下：

8、5’-uaauuucuacuaaguguagau uuaaguaucccuauccucua(seq id no：8)-3’，

9、具有g-四链体dna酶切割位点的g-四联体，其序列如下：

10、gggttttttgggttttttgggttttttggg(seq id no：12)。

11、在一种实施方式中，所述引物对在pcr反应体系中的浓度为9μm。

12、在一种实施方式中，在crispr-cas12a反应体系中，cas12a蛋白与所述grna的摩尔浓度比为1:0.8。

13、另一方面，本技术还提供了一种用于特异性检测嗜水气单胞菌的试剂盒，所述试剂盒含有所述的试剂。

14、在一种实施方式中，所述试剂盒还包括primer free反应缓冲液、cas12a蛋白、10×反应缓冲液、阳性对照物以及阴性对照物。

15、在一种实施方式中，所述阳性对照物为嗜水气单胞菌(edwardsiella ictaluri)atcc15947标准菌株提取的基因组dna，所述阴性对照物为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)atcc25922标准菌株提取的基因组dna。

16、另一方面，本技术还提供了所述的试剂和/或所述的试剂盒在以下i)～iii)任一种中的应用：

17、i)、非疾病诊断治疗目的地检测嗜水气单胞菌；

18、ii)、制备检测嗜水气单胞菌的产品；

19、iii)、筛选药物，所述药物用于预防嗜水气单胞菌感染、防治嗜水气单胞菌引起的疾病和/或抑制嗜水气单胞菌的增殖。

20、在一种实施方式中，所述试剂和/或试剂盒在应用时，pcr反应体系的组成包括：质量浓度为10μm的上游引物1-fw 1μl，质量浓度为10μm的下游引物1-rv 1μl，primer free反应缓冲液10ul，2ul嗜水气单胞菌基因组dna，depc水补足至20μl；和/或，

21、crispr-cas12a反应体系组成包括：4μl 10×反应缓冲液，质量浓度为10μm的cas12a蛋白0.4μl，质量浓度为2μm的grna 4μl，29.6μl h2o，1μlpcr扩增产物，质量浓度为10μm的g-四链体1μl；和/或，

22、显色反应体系组成包括：crispr-cas12a反应体系40μl，质量浓度为10μm的血红素5μl，2μl kcl、3μl h2o和50μl含h2o2的可溶性tmb底物溶液。

23、在一种实施方式中，所述试剂和/或试剂盒在应用时，pcr反应的扩增程序包括：95℃5min；95℃15s、55℃15s，72℃45s，40个循环；72℃反应7min；和/或，

24、在crispr-cas12a检测中，将反应体系混合于37℃下反应1小时，再通过在65℃加热10min终止反应；和/或，

25、在显色反应检测中，将显色反应体系于室温下在黑暗中反应20min，通过裸眼观察结果。

26、另一方面，本技术还提供了一种用于检测嗜水气单胞菌感染的装置，所述装置包括：

27、样品扩增模块：用于提取待测样本的基因组dna，使用所述的试剂和/或所述的试剂盒对所述基因组dna进行pcr扩增；

28、crispr-cas12a反应模块：用于对所述样品扩增模块获得的pcr产物进行crispr-cas12a反应；

29、显色模块：用于对所述crispr-cas12a反应模块获得的反应结束的体系进行显色反应检测；

30、结果分析模块：用于对显色反应结束后的反应体系颜色进行判定，当最终反应体系为无色时，判定为阳性；当最终反应体系为蓝绿色时，判定为阴性。

31、另一方面，本技术提供了一种非诊断目的地嗜水气单胞菌的检测方法，包括：

32、步骤1)、获得待测样本的基因组dna；

33、步骤2)、采用所述的试剂和/或所述的试剂盒对所述待测样本的基因组dna进行pcr扩增、crispr-cas12a反应和显色反应；

34、步骤3)、根据反应结果观察判定样本中是否含有嗜水气单胞菌的目标基因，当最终反应体系为无色时，判定为阳性；当最终反应体系为蓝绿色时，判定为阴性。

35、其中，crispr-cas12a基因编辑技术(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats and crispr associated protein)对单链(ss)dna具有非特异性切割活性，并已用于将序列特异性信息转换为荧光、电化学和显色信号。基于这一原理，crispr-cas12a常用于特异性检测pcr和pcr的扩增产物。基于pcr核酸扩增的方法和crispr-cas系统的结合，极大地提高了目标rna/dna检测的灵敏度和特异性。在crispr-cas12a系统中，cas12a蛋白在grna(guide rna)的引导下，识别目标序列后启动“旁路切割”活性，特异性识别目标靶基因序列。通过pcr与cas12a蛋白的偶联，能够实现“序列扩增”(pcr完成)加上“酶促级联”(cas蛋白完成)的两级放大，超越qpcr单级扩增的灵敏度。而且可以摆脱现有检测方法对实时荧光pcr仪等精密仪器的依赖，使得crispr-cas12a技术在致病菌的现场快速检测方面具有广阔的应用前景。

36、本发明将pcr扩增和crispr-cas12a反式切割dna酶过程结合。通过pcr扩增嗜水气单胞菌的特异性基因序列，通过crispr-cas12a系统鉴定pcr扩增产物。应用的grna用于pcr扩增子的特异性鉴定，以消除非特异性扩增产生的假阳性。当样品中存在嗜水气单胞菌，其特异性基因序列经过pcr扩增，cas12a的反式切割活性由pcr扩增产物激活，切割ssdnag-四链体并阻止g-四结构体的形成，抑制过氧化物酶样活性，不能催化tmb氧化的显色反应，显色反应产物为无色，不发生颜色变化。相反，当不存在嗜水气单胞菌特异性基因序列，未发生pcr扩增时，crispr-cas12a/grna复合物的活性没有被激活，不能反式切割单链dna的g-四链体，完整的g-四链体可以结合血红素并催化tmb氧化，显色反应产物为蓝绿色。通过这种方式，可以通过阳性样本(无色)和阴性样本(蓝绿色)之间的色差区分结果。

37、本技术至少具有如下有益效果：

38、1、相比于应用成熟广泛的实时荧光pcr方法，本发明不需要价格昂贵的实时荧光pcr仪，通过肉眼即可观察检测结果颜色变化，检测水产养殖动物及水产品中是否含有嗜水气单胞菌，可以应用于水产养殖现场及基层实验室快速检测，进一步完善了水产养殖病害的快速检测方法，提高了水产养殖病害检测的准确性和实用性；

39、2、本发明建立的pcr结合crispr-cas12a显色可视快检新方法具有良好的特异性，与温和气单胞菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌等其他近属致病菌均无交叉反应，极大提高了crispr-cas12a技术在水产养殖人鱼共患致病菌现场检测的应用效率；

40、3、本技术还通过对嗜水气单胞菌特异性靶标序列选定、pcr扩增引物对和grna的设计和筛选，最终得到了具有扩增效率高、灵敏度好且特异性强的可现场快速检测使用的引物组和grna，缩短了嗜水气单胞菌的检测时间，可在90min内完成检测，最低可以检测2.38ng/μl的嗜水气单胞菌，具有灵敏度高、特异性强、快速准确、操作简单快捷、不易造成实验室污染等优点，为水产养殖病害的快速检测提供了新方法，满足一线水产养殖企业和基层实验室对于水产养殖疫病进行快速诊断的需要。