级联放大HCR免疫诊断试剂及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及级联放大hcr免疫诊断试剂及其应用。

背景技术：

1、现代医学领域，许多疾病的诊断和治疗都依赖一定的检测技术，无论是分子水平的核酸和蛋白质，还是细胞水平的分析都需要高灵敏度高特异度的技术来提高检测的准确性。目前，临床常用的检测手段主要包括核酸扩增、直接镜检及免疫学诊断。其中核酸扩增被认为是高灵敏高特异的检测技术之一，而免疫学诊断方法因结果的判断较为复杂、耗时长且成本较高导致难以普及或广泛使用。

2、目前主流的免疫诊断技术包括酶联免疫法(elisa)、时间分辨荧光法(trfia)、化学发光法(clia)、胶体金法四种。其中，酶联免疫吸附利用酶与样本反应，依据颜色变化程度确定结果，该方法检测灵敏度不高、操作方法复杂、耗时较长，受酶影响较大；时间分辨荧光根据同位素的发光特点，用时间分辨技术测量荧光来确定结果，该方法操作过于复杂；化学发光法将抗原抗体同样本结合，然后由磁珠捕捉反应物，加入发光促进剂加大反应发光强度，进而判定诊断结果，该方法制造成本太高，难以普及或广泛使用。

3、而与此相比，核酸扩增技术已经非常完善，主要分为两大类：热循环扩增和等温扩增。相对于热循环扩增，等温扩增外部条件要求更简单，不需要额外的仪器辅助变温，甚至可以在室温下反应，其中以hcr为基础的等温扩增得到人们的广泛关注。hcr反应是由pierce和dirks在2004年提出的一种体外核酸等温信号放大技术，是一个没有酶参与的过程。hcr的优点在于不需要酶的辅助，避免了非特异性扩增对分析结果的影响，反应条件温和、易控制，等温条件下经一步反应就可以实现短链dna的扩增，并不需要复杂的仪器设备，大大降低了成本。

4、假如能够将hcr这一信号扩增技术与各类检测技术荧光法、比色法、电化学法等联合使用，则有望在免疫诊断中能获得很高的灵敏度，并使结果的判读便的更加快速容易。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供级联放大hcr免疫诊断试剂及其应用，该检测试剂中包括hcr反应试剂，用于免疫检测的信号放大。

2、级联放大hcr反应试剂，

3、其包括：trigger探针、hcr-1试剂和hcr-2试剂；

4、所述trigger探针由片段b*和片段a*组成，其5’端标记生物素；

5、所述hcr-1试剂包括h1探针和h2探针；

6、所述h1探针，其由片段a、片段b、片段c和片段b*组成，其5’端标记荧光基团；

7、所述h2探针，其由片段d、片段b*、片段a*、片段b、片段c*和片段e组成，其3’端标记淬灭基团；

8、所述hcr-2试剂包括h3探针、h4探针、h5探针和h6探针；

9、所述h3探针，其由片段e*、片段d*、片段f和片段d组成且5’端标记荧光基团；

10、所述h4探针，其由片段d、片段g、片段d*和片段f*组成且3’端标记淬灭基团；

11、所述h5探针，其由片段g*、片段d*、片段h和片段d组成且3'端标记荧光基团；

12、所述h6探针，其由片段d、片段e、片段d*和片段h*组成且5’端标记淬灭基团；

13、其中，

14、片段a与片段a*反向互补，长度为5～10bp；

15、片段b与片段b*反向互补，长度为10～20bp；

16、片段c与片段c*反向互补，长度为5～10bp；

17、片段d与片段d*反向互补，长度为15～20bp；

18、片段e与片段e*反向互补，长度为5～10bp；

19、片段f与片段f*反向互补，长度为5～10bp；

20、片段g与片段g*反向互补，长度为5～10bp；

21、片段h与片段h*反向互补，长度为5～10bp。

22、杂交链式反应(hcr)是一种高效的核酸探针信号放大方法，利用核酸链之间的竞争作用实现杂交，并且以此作为能量来源实现信号放大，该反应具有等温无酶的特点。本发明将hcr系统作为免疫检测的信号放大系统。将免疫复合物通过生物素-亲和素连接桥与hcr反应体系结合，从而对其产生的信号进行放大。

23、本发明所述hcr反应试剂中，

24、trigger探针中从5’端至3’端，依次连接片段a*和片段b*，或者依次连接片段b*和片段a*，本发明对此不做限定。trigger作为hcr系统反应的启动子。在引发链trigger的5'标记生物素，引物链trigger由a*、b*两部分序列组成。

25、h1探针中，从5’端至3’端依次连接片段a、片段b、片段c和片段b*，5'端标记荧光基团。

26、h2探针中，从5’端至3’端依次连接片段d、片段b*、片段a*、片段b、片段c*和片段e，3’端标记淬灭基团。

27、hcr-1作为一级放大系统，包含探针h1、h2，在探针h1的5'标记荧光基团alexafluor 488，探针h2的3'标记淬灭基团bhq1。h1包含a、b、b*、c四部分序列，其中b与b*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，c为发卡结构的环部，a为h1的5'端单链黏性末端；h2包含a*、b、b*、c*、d、e五部分序列，其中b与b*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，a*为发卡结构的环部，c*为3'端单链黏性末端，d为5'端序列，e为3'端序列。当hcr-1放大系统中没加入引发链trigger时，h1、h2会在缓冲液中稳定共存；当加入引发链trigger后，杂交链式反应启动。引发链trigger中a*、b*两部分序列跟h1中a、b序列产生杂交反应，h1打开暴露出c、b*两部分序列，c、b*两部分序列继续跟h2中的b、c*序列产生杂交反应，打开h2暴露出a*、b*、d、e四部分序列，h2暴露出来的a*、b*两部分序列与引物链trigger中a*、b*两部分序列一致，依次会继续跟h1产生杂交反应，重复循环上述反应过程，最终生成一条双链dna链产物。

28、本发明实施例中，还包括二级放大系统，即hcr-2。

29、hcr-2放大系统中，包括h3探针、h4探针、h5探针和h6探针；

30、所述h3中，从5’端至3’端依次连接片段e*、片段d*、片段f和片段d，且5’端标记荧光基团；

31、所述h4中，从5’端至3’端依次连接片段d、片段g、片段d*和片段f*，且3’端标记淬灭基团；

32、所述h5中，从5’端至3’端依次连接片段g*、片段d*、片段h和片段d，且3'端标记荧光基团；

33、所述h6中，从5’端至3’端依次连接片段d、片段e、片段d*和片段h*，且5’端标记淬灭基团；

34、其中，

35、片段d与片段d*反向互补，长度为15～20bp；

36、片段e与片段e*反向互补，长度为5～10bp；

37、片段f与片段f*反向互补，长度为5～10bp；

38、片段g与片段g*反向互补，长度为5～10bp；

39、片段h与片段h*反向互补，长度为5～10bp。

40、hcr-1系统中h2反应暴露出来的d、e两部分序列作为hcr-2系统的引发链。h3的5'标记荧光基团alexa fluor 488，h4的3'标记淬灭基团bhq1，h5的3'标记淬灭基团bhq1，h6的5'标记荧光基团alexa fluor488。h3包含d、f、d*、e*四部分序列，其中d与d*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，f为发夹结构的环部，e*为5'端单链黏性末端；h4包含f*、d*、g、d四部分序列，其中d与d*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，g为发夹结构的环部，f*为3'端单链黏性末端；h5包含d、h、d*、g*四部分序列，其中d与d*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，h为发夹结构的环部，g*为5'端单链黏性末端；h6包含h*、d*、e、d四部分序列，其中d与d*碱基互补配对成双链为发夹结构茎部，e为发夹结构的环部，h*为3'端单链黏性末端。hcr-1系统发生杂交链式反应后，产物中暴露出来的d、e两部分序列作为hcr-2系统的引发链，跟h3中d*、e*序列产生杂交反应，h3打开暴露出d、f两部分序列；d、f两部分序列继续跟h4中的d*、f*序列产生杂交反应，h4打开暴露出d、g两部分序列；d、g两部分序列继续跟h5中的d*、g*序列产生杂交反应，h5打开暴露出d、h两部分序列；d、h两部分序列继续跟h6中的d*、h*序列产生杂交反应，h6打开暴露出d、e两部分序列；h6反应暴露出来的d、e两部分序列刚好作为hcr-2系统的引发链，依次会继续跟发夹探针h3产生杂交反应，重复循环上述反应过程，最终生成一条双链dna链产物。

41、本发明一些实施例中：

42、片段a的序列为gagatt；

43、片段b的序列为aggtaatcgcgcaagcgt；

44、片段c的序列为aagtctg；

45、片段d的序列为accttcgctatcgcttcat；

46、片段e的序列为ctacacat；

47、片段f的序列为aattcgg；

48、片段g的序列为ctaatgg；

49、片段h的序列为tcctgtg。

50、一些具体实施例中，以hcr-1系统对信号进行放大后，再以hcr-2系统对信号进行放大，在此实施例中：

51、所述trigger探针的5’修饰生物素，其核酸序列为：

52、acgcttgcgcgattacctaatctc；

53、所述h1探针的5’端修饰荧光基团，其核酸序列为：

54、gagattaggtaatcgcgcaagcgtaagtctgacgcttgcgcgatta cct；

55、所述h2探针的3’端修饰淬灭基团，其核酸的序列为：

56、accttcgctatcgcttcatacgcttgcgcgattacctaatctcaggtaatcgcgcaagcgtcagacttctacacat。

57、所述h3探针的5’端修饰荧光基团，其核酸序列为：

58、atgtgtagatgaagcgatagcgaaggtaattcggaccttcgctatcg cttcat

59、所述h4探针的3’端修饰淬灭基团，其核酸的序列为:

60、accttcgctatcgcttcatctaatggatgaagcgatagcgaaggtcc gaatt；

61、所述h5探针的5’端修饰荧光基团，其核酸序列为：

62、ccattagatgaagcgatagcgaaggttcctgtgaccttcgctatcgc ttcat；

63、所述h6探针的3’端修饰淬灭基团，其核酸的序列为：

64、accttcgctatcgcttcatctacacatatgaagcgatagcgaaggtc acagga。

65、在本发明中，所述荧光染料优选为alexa 系列染料，一些实施例中，所述荧光染料为alexa 488。所述淬灭基团为bhq1。

66、因此，本发明提供了所述的级联放大hcr反应试剂在制备免疫检测的信号报告试剂中的应用。

67、本发明还提供了一种免疫检测试剂，包括试剂r[m]、试剂r1[a]、试剂r2[b]和权利要求1～4任一项所述的hcr反应试剂；

68、所述试剂r[m]中包括被捕获抗体包被的磁珠；

69、所述试剂r1[a]中包括生物素化的检测抗体；

70、所述试剂r2[b]中包括链霉亲和素试剂。

71、本发明所述试剂，磁珠的直径为2～3μm，所述磁珠表面修饰修饰亲和素。所述捕获抗体能够特异性识别待测物且连接有生物素。所述磁珠通过表面修饰的甲苯磺酰基与亲和素连接，与连接有生物素的捕获抗体相连。具体的，采用表面功能基团甲苯磺酰基、疏水性，优选直径2.8μm，浓度10mg/ml，批间一致性cv<3％超顺磁性、表面修饰羧基功能团、均一性cv<4％的链霉亲和素磁珠作为固相载体。

72、一些实施例中，所述免疫检测试剂中还包括pbst缓冲液和pbs缓冲液。

73、本发明构建了一种基于级联杂交链式反应hcr信号放大系统的免疫方法，其以如前所述的免疫检测试剂对样品进行检测。

74、本发明采用超顺磁性、表面修饰羧基功能团、均一性cv<4％的羧基磁珠作为固相载体。加入edc/nhs进行活化处理，羧化物(-cooh)可能与nhs或者磺基-nhs反应，形成一个半稳定的nhs或者磺基-nhs酯。将适量的捕获抗体分散在ph6.0的mest缓冲液中，并以此溶液重新分散磁珠，将溶液加入洗涤完全的磁珠中，在室温条件下孵育2小时，nhs或者磺基-nhs酯可以继续与抗体上的伯胺(-nh2)反应，形成稳定的酰胺键将磁珠与捕获抗体相连。待偶联完成后，加入足量pbst溶液，进行涡流洗涤。依次加入tbst缓冲液进行淬灭，加入含有0.1～2％bsa、5％脱脂奶粉、1％明胶、10％小牛血清的pbs缓冲液作为封闭剂，重新分散磁珠，在4℃条件下封闭过夜，将未参与反应的已活化羧基进行封闭。

75、本发明采用间接法夹心免疫原理。将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质，加检测抗体，使固相免疫复合物上的抗原与检测抗体结合。检测抗体用生物素进行标记，将生物素与n-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素n-羟基丁二酰亚胺酯(bnhs)，bnhs分子酯健中的-c＝o基团可以与抗体上的自由氨基结合，从而将生物素与抗体共价结合。

76、本发明采用链霉亲和素(streptavidin)作为抗体与引物之间的连接桥，形成完整的免疫检测工艺：羧基磁珠-捕获抗体-待测样本-检测抗体-链霉亲和素-级联hcr放大系统。取适量加入固相免疫复合物中，通过链霉亲和素使固相免疫复合物与级联hcr系统trigger引发链相连，当检测样本中存在目标分子，hcr释放荧光信号，通过流式细胞仪或倒置荧光显微镜检测荧光信号。

77、反应过程为：磁珠—捕获抗体—待测样本—检测抗体-生物素—链霉亲和素—生物素-trigger—级联hcr放大系统

78、所述检测包括如下步骤：

79、将h1探针和h2探针混合，经变性后退火，制得hcr-1试剂；

80、将h3探针和h4探针混合，经变性后退火，制得hcr-2-1试剂；

81、将h5探针和h6探针混合，经变性后退火，制得hcr-2-2试剂；

82、将试剂r[m]、样品和试剂r1[a]混合孵育，磁分离、洗涤；

83、加入试剂r2[b]和trigger试剂，经孵育后，磁分离、洗涤；

84、加入hcr-1试剂、hcr-2-1试剂、hcr-2-2试剂，经孵育后，磁分离、洗涤后检测荧光强度。

85、本发明通过优化捕获抗体、生物素化检测抗体、链霉亲和素、引物、h1及h2的加入浓度，封闭剂的选择，hcr反应时间及温度，得到的该免疫诊断的最优条件。

86、一些具体实施例中：hcr-1试剂的制备中，变性、退火的条件包括：90℃条件下反应5min，然后以1℃/min降温至50℃。

87、一些具体实施例中：hcr-2-1试剂的制备中，变性、退火的条件包括：90℃条件下反应5min，然后以1℃/min降温至50℃。

88、一些具体实施例中：hcr-2-2试剂的制备中，变性、退火的条件包括：90℃条件下反应5min，然后以1℃/min降温至50℃。

89、试剂r[m]、样品和试剂r1[a]混合孵育的条件包括37℃孵育30min。

90、加入试剂r2[b]和trigger试剂混合孵育的条件包括37℃避光孵育18分钟。

91、加入hcr-1后孵育的条件包括37℃避光孵育30分钟。

92、加入hcr-2-1、hcr-2-2试剂后孵育条件包括37℃避光孵育30分钟。

93、本发明还提供了一种免疫检测方法，其以所述的免疫检测试剂对样品进行检测。

94、本发明所述样品包括任何可以通过抗体识别的样品，包括但不限于来自于植物、动物或微生物的样品。所述来自动物的样本为来自于人类或其他动物的样本，包括但不限于血液、血清、血浆、离体组织。

95、本发明建立了一种基于级联杂交链式反应hcr信号放大系统的免疫方法。结合免疫磁珠法、生物素-亲和素系统、流式荧光检测平台，建立了一种简单、无酶、高灵敏度的体外诊断方法。级联放大hcr免疫诊断方法利用两级hcr信号放大系统，极大的提升了诊断灵敏度，可实现微量蛋白质及小分子等疾病标志物的检测，可用于部分疾病的预测，愈后监控等方面。