一种苏氨酸提取废液和/或发酵液在发酵生产L-异亮氨酸中的应用及发酵方法与流程

本发明属于生物发酵领域，尤其涉及一种苏氨酸提取废液和/或发酵液在发酵生产l-异亮氨酸中的应用及发酵方法。

背景技术：

1、l-异亮氨酸为支链氨基酸的一种，属于必需氨基酸，是合成人体激素、酶类的原料，参与调节生物的新陈代谢过程，在人体生命活动中起重要作用，并被广泛应用于医药、食品和饲料领域。在医药方面，l-异亮氨酸和另外两种支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸)除用于一般营养复合氨基酸输液外，还被用于配制治疗型特种氨基酸输液，对治疗脑昏迷、肾病等具有显著疗效，是较为昂贵的氨基酸原料药之一；同时，l-异亮氨酸很容易转化为葡萄糖，因此有助于调节血糖水平。在食品领域，作为一种添加剂，l-异亮氨酸不仅能有效防止肌肉损伤，参与肌肉修复，提高个体耐力，而且还能提高生长激素产量，帮助燃烧内脏脂肪。在饲料领域，添加适量的l-异亮氨酸可以改善牲畜的回肠屏障功能，预防腹泻等疾病，通过在饲料中添加适量的l-异亮氨酸，可以提高饲料的营养价值和利用率，加快牲畜生长速度，降低养殖成本。

2、本技术发明人发展了以苏氨酸作为前体发酵生产l-异亮氨酸的方法，例如申请人已公布的专利文献(cn114410701a)通过基因工程菌株，实现了在添加前体物质苏氨酸的条件下，l-异亮氨酸的高效生产，但其中使用的苏氨酸来源于工程菌株发酵后的苏氨酸成品。

3、苏氨酸生产在氨基酸产业中占有重要地位，目前主要采用发酵法生产，通过苏氨酸生产菌株进行发酵，发酵液经陶瓷膜过滤去除菌体，过滤后的上清液经浓缩结晶、离心分离和干燥等工艺操作获得苏氨酸成品。

4、苏氨酸生产过程中会产生大量的提取废液，该废液含有苏氨酸、残糖、无机盐和其他杂质氨基酸等成分，如何处理苏氨酸提取废液，一直为苏氨酸生产企业所关注：如作为废水处理后排放，不仅周期长，成本高，且造成资源浪费；如直接作为饲料添加剂使用，附加值相对较低；部分企业采用多效蒸发喷雾干燥生产固体有机复混肥技术处理苏氨酸提取废液，成本相对较高，附加值相对较低。

5、如果能将苏氨酸发酵液或提取废液不经任何处理直接用于发酵生产异亮氨酸，即直接使用苏氨酸发酵液或提取废液来提供生产异亮氨酸的前体物质苏氨酸，不仅能够省去苏氨酸发酵液处理过程，极大的降低了生产成本；而且能够降低处理提取废液的成本。

技术实现思路

1、为改善现有技术的不足，本发明具体提供：

2、本发明第一方面提供一种苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液在微生物发酵中的应用，优选发酵生产氨基酸的应用，再优选发酵生产以苏氨酸为前体氨基酸中的应用，进一步优选发酵生产l-异亮氨酸的应用，优选用做发酵培养基和/或发酵补料液。

3、本发明第二方面提供一种发酵生产l-异亮氨酸的培养基，包括苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液。

4、根据本发明，所述培养基中苏氨酸的浓度为5-50g/l，优选地，所述培养基中苏氨酸的浓度为5-30g/l，进一步优选地，所述培养基中苏氨酸的浓度为5-18g/l。

5、根据本发明的实施方案，所述培养基的ph为6.5-7.5。

6、根据本发明的实施方案，所述培养基包含碳源、苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液。

7、根据本发明的实施方案，所述培养基进一步包含镁盐。

8、根据本发明的实施方案，所述培养基进一步包含氮源、镁盐外其他无机盐、生长因子中的一种或多种。

9、根据本发明的实施方案，所述氮源的浓度为0-15g/l，所述氮源选自铵盐，例如为硫酸铵。

10、根据本发明的实施方案，所述无机盐的浓度为0-10g/l，所述无机盐选磷酸盐、镁盐、钾盐中的至少一种，例如为磷酸二氢钾和七水硫酸镁。

11、根据本发明的实施方案，所述生长因子的浓度为0-6g/l，所述生长因子选自甜菜碱、烟酸或维生素b1的至少一种。

12、根据本发明的实施方案，所述碳源的浓度为0-40g/l，所述碳源选自葡萄糖。

13、本发明第三方面还提供上述含苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液培养基的配制方法，包括：

14、1)苏氨酸提取废液或苏氨酸发酵液稀释、调节ph至7.0-8.0，离心或过滤去除固体杂质；

15、2)加入碳源、氮源、无机盐、生长因子中的一种或多种。

16、根据本发明的实施方案，所述稀释为用水对苏氨酸提取废液按不同质量比1∶(3-10)进行稀释。

17、本发明第四方面提供一种发酵生产l-异亮氨酸的发酵补料液，所述发酵补料液包括苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液，所述苏氨酸提取废液、苏氨酸发酵液具有如上所述的定义。

18、根据本发明的实施方案，所述发酵补料液和/或苏氨酸发酵液使发酵液中的苏氨酸浓度维持3-15g/l，优选维持5-10g/l。

19、根据本发明的实施方案，所述发酵补料液还包括葡萄糖补料液和/或氨水。

20、本发明第五方面提供一种利用苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液发酵生产l-异亮氨酸的方法，包括将可利用苏氨酸为原料生产异亮氨酸微生物加入如上所述的培养基进行发酵，培养结束后从培养物中分离出l-异亮氨酸。

21、根据本发明的实施方案，所述生产异亮氨酸微生物包括但不限于野生型、筛选或经基因工程改造的大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌(bacillus)、短杆菌(brevibacterium)、酵母(yeast)、棒杆菌(corynebacterium)或链霉菌(streptomyces)等。

22、根据本发明的实施方案，所述生产异亮氨酸微生物选自基因工程菌株，所述基因工程菌株表达解除了l-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因。

23、在一些实施方案中，所述解除了l-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因为解除型ilva基因或tdcb基因，优选为解除型ilva基因。

24、在一些实施方案中，所述基因工程菌株中进一步表达乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了l-异亮氨酸和/或l-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸和/或l-缬氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvih基因、解除型ilvbn基因、解除型ilvgm基因、解除型alss基因中的一种或多种。

25、在一些实施方案中，所述基因工程菌株进一步表达苏氨酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvc)、二羟酸脱水酶或脱氨酶基因(ilvd)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilve)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。

26、在一些实施方案中，所述基因工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，所述基因工程菌株中乙醇、乙酸、乳酸为代表的杂酸杂醇代谢副产物的生成通路被减弱或阻断，例如下列基因ldha、adhe、pta、poxb的活性分别或同时被减弱或消除。

27、在一些实施方案中，所述基因工程菌株敲除下列基因：ldha、pta、poxb、adhe、pflb、mgsa、frda、dada、avta、ilve。

28、在一些实施方案中，所述基因工程菌株为基因工程改造过的大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌(bacillus)、短杆菌(brevibacterium)、酵母(yeast)、棒杆菌(corynebacterium)或链霉菌(streptomyces)。

29、根据本发明的实施方案，所述发酵培养温度35-39°，转速500-1500r/min，通气量0.6-1.7v/v/m。

30、根据本发明的实施方案，所述发酵培养溶氧控制在8％以上，例如为15-30％。

31、根据本发明的实施方案，所述方法包括如下步骤：

32、s1)制备种子液；

33、s2)将种子液接种在上述发酵培养基中，接种量为5％-15％，发酵培养。

34、根据本发明的实施方案，所述发酵培养的温度为36℃-38℃，发酵周期为24-40h。

35、根据本发明的实施方案，发酵中还包括如下步骤：流加补料液，所述补料液选自葡萄糖补料液、苏氨酸补料液、苏氨酸提取废液、苏氨酸发酵液、氨水中的至少一种，优选使用苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液替代苏氨酸补料液。

36、作为一个实例，流加补料液包括：流加500g/l的葡萄糖补料液使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1-10g/l；流加苏氨酸提取废液或苏氨酸补料液和/或苏氨酸发酵液使发酵液中的苏氨酸浓度维持在3-15g/l，流加氨水使发酵液的ph维持在6.5-7.5。

37、有益效果

38、申请人基于前期专利的基本逻辑和创新性的发散性思维，发现苏氨酸发酵液和/或苏氨酸提取废液中的有效苏氨酸及其它营养成分能够满足异亮氨酸生产菌种的生长所需，在适宜的条件下可以顺利产出异亮氨酸，从而完成了本发明。

39、具体地，本发明提出利用苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液发酵生产l-异亮氨酸的方法，通过将苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液经过适当处理或不处理，作为发酵培养基的主体成分，仅向其中添加必需营养成分，即能够利用异亮氨酸生产菌将废液中的苏氨酸转化为l-异亮氨酸，显著降低l-异亮氨酸生产的原料成本，同时还实现了苏氨酸提取废液的高效资源化利用，减少废液排放和分离纯化等后处理成本，为发酵行业废液处理提供了另一种思路，具有非常良好的经济效益与社会效益；同时，不需要对苏氨酸发酵液进行纯化分离等处理，直接用于l-异亮氨酸生产，能够有效降低成本，同时，提高发酵液中苏氨酸以及其他营养物质的利用率。

40、本发明的培养基，基因工程菌可以利用苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液中的氮源、磷酸盐、糖质原料等物质，因此，与直接使用全培养基相比，可以减少甚至完全不添加氮源、无机盐、生长因子，就能发酵生产l-异亮氨酸；不仅将苏氨酸提取废液和/或苏氨酸发酵液中的氨基酸、氮源、无机盐、糖质等物质合理利用，同时降低了额外氮源、无机盐、生长因子的用量，有效降低培养基制备成本。