一种甘薯软腐病抗性鉴定方法

本发明属于作物抗性育种，具体的说，涉及一种甘薯软腐病抗性鉴定方法。

背景技术：

1、甘薯软腐病，由接合菌亚门的匍枝根霉rhizopus stolonifer(ehr ex fr.)vuill.引起，为甘薯贮藏期间主要病害之一。甘薯薯块感染软腐病后，薯块表面会出现灰白色的霉斑，之后会逐渐变为暗色或黑色的霉斑；病原菌在侵染过程中会分泌果胶酶、淀粉酶、纤维素分解酶等，分解寄主细胞中的胶层及其他成分，使薯块的组织细胞离析，薯块薄壁组织出现软烂、水烂(故甘薯软腐病俗称水烂)，使病变部位逐渐转变为水浸状物质，故软腐病又被称为水烂；最后病变部位表面会形成大量灰黑色菌丝和孢子囊。该种病菌在空气、薯皮甚至是窖土中都可存留一段时间，一旦暴发，会对甘薯产量与品质造成极大的影响，如得不到及时防控，极可能导致全窖薯块尽皆腐烂的状况也是常有的，会造成严重的经济损失。

2、在生产上，防治主要使用的是杀菌剂，可在一定程度上控制和减小该病害的损失，然而生化防治不但会增加生产成本，而且会对导致生态环境造成破坏，并和诱发潜在的食品安全问题，更让人担忧的是同时也易，生物防治极易诱导导致病原菌产生抗药性，最终影响导致防治效果不稳定。因此选育和推广抗病品种是防治该病最经济有效安全绿色可靠的方法，而抗性鉴定是抗病育种研究的前提和基础。

3、目前甘薯软腐病抗性鉴定主要采取的方法是薯片接种菌碟的技术方法。即在一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，每个品种取3块中等大小的薯块，经严格消毒晾干后，切薯块中部薯片，每薯块切3个薯片，每薯片厚度为8mm，置于放有灭菌湿润滤纸保湿的灭菌培养皿中，接种1块6mm的甘薯软腐病菌菌碟于薯片中央，将接种好的薯片置于26℃生化培养箱中培养，期间加无菌水保湿一次；21小时后将鉴定材料取出，量取薯片发病直径，分别计算防效，以平均防效进行分级，评价品种的抗感特性。该方法效果较好，可在较短时间内使薯片感病，筛选时间较短，然而，对于抗性鉴定而言，类似该方法仍存在一定的不少弊端，不但破坏了甘薯薯块本身的完整性，而且在薯块内部组织的抗性物质较少时，较易感病，这些技术缺陷直接影响到抗性鉴定的可靠性使得结果准确性较低。

4、综上所述，采用甘薯薯片接菌侵染虽然鉴定快，但此方法准确性较低，且破坏了甘薯薯块完整性，因此整体鉴定效率较低。因此，需要对该技术进行改进。

技术实现思路

1、本发明要解决的问题是提供一种使用方便、能快速有效区分抗性的甘薯软腐病抗性鉴定方法。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，包括以下几个步骤：

3、s1、菌丝悬浮液制备；

4、s2、甘薯薯块打孔孢子液接种；

5、s3、抗性评价；

6、所述s1具体为：

7、s1.1、病原菌分离和准备；

8、s1.2、甘薯准备；

9、所述s1.1具体为：

10、s1.1.1、从甘薯库中取带软腐病薯块，按常规消毒；

11、s1.1.2、用无菌刀将s1.1.1中经过常规消毒的带软腐病薯块的病健交接处的组织切成薄片移到pda培养基上培养；

12、s1.1.3、于26℃下在pda平板上培养，获病原菌纯培养；

13、s1.1.4、在活化1天后的软腐病菌平板中打取6mm菌碟，将菌碟置于pda培养基平板中央；

14、s1.1.5、在带菌pda平皿其中加入约5m l无菌水(含0.05％吐温20)，用涂布器轻刮平板上的病原菌孢子，配制浓度为1×106的孢子悬浮液；

15、所述s2具体为：

16、s2.1、用灭菌打孔器在薯块赤道部位均匀刺出一定深度的伤口，并用移液枪接入20μl，1×106cfu的软腐病孢子悬浮液，以清水做对照；

17、s2.2、待薯块上孢子悬浮液不再溢流后置于培养箱内；

18、所述s3具体为：

19、s3.1、接种3-5d后将接种软腐病部位切片，采用图像分析扫描系统扫描计算烂薯面积占整个薯片面积百分比，分析各待抗性鉴定的甘薯的病情指数；根据甘薯软腐病病情指数进行品种的抗感特性评价；

20、s3.2、接种后1-5d，调查每个品种的发病薯块的数量。

21、进一步的，所述s2.1中用灭菌打孔器在薯块赤道部位均匀刺深度为5mm的伤口。

22、进一步的，s2.2中所述待薯块上孢子悬浮液不再溢流后置于培养箱内，其温度条件为25℃，湿度为90％。

23、进一步的，所述s1.1.4中将菌碟置于pda培养基平板中，温度条件为25℃并培养4d。

24、进一步的，所述s1.2具体为：

25、s1.2、甘薯准备；

26、s1.2.1、选择外观整齐的，无任何病虫化、机械损伤的甘薯；

27、s1.2.2、经自来水清洗薯块表面泥土，用75％酒精消毒后，再用2％ naclo消毒10s灭菌；

28、s1.2.3、使用纯净水清洗后过夜晾干。

29、进一步的，所述s1.1.2中，带软腐病薯块的病健交接处的组织在pda培养基上培养后，需要经分离纯化，并经柯赫氏法则验证确定。

30、采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。

31、1、本发明中，将现有方法菌饼改为孢子液作为病源接种，孢子悬浮液制备培养时间短，制备简易、快速、量大且培养箱保存5天内致病力不变，有利于大规模鉴定。

32、2、本发明中，采用整薯打孔接菌代替薯片接菌，接菌后置于培养箱内在可控环境下，避免了环境因素对鉴定结果的影响鉴定结果更稳定更准确，采用整薯接菌法更符合产业中真实情况，解决了现有技术中待感病材料发病21h即统计发病情况存在的不能较为准确区分较为抗性材料的抗性等级的问题，本发明3-5天统计发病情况更符合实际情况，较为科学。

技术特征：

1.一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

2.根据权利要求1所述的一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，其特征在于，所述s2.1中用灭菌打孔器在薯块赤道部位均匀刺深度为5mm的伤口。

3.根据权利要求1所述的一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，其特征在于，s2.2中所述待薯块上孢子悬浮液不再溢流后置于培养箱内，其温度条件为25℃，湿度为90％。

4.根据权利要求1所述的一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，其特征在于，所述s1.1.4中将菌碟置于pda培养基平板中，温度条件为25℃并培养4d。

5.根据权利要求1所述的一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，其特征在于，所述s1.2具体为：

6.根据权利要求1所述的一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，其特征在于，所述s1.1.2中，带软腐病薯块的病健交接处的组织在pda培养基上培养后，需要经分离纯化，并经柯赫氏法则验证确定。

技术总结
本发明公开了一种甘薯软腐病抗性鉴定方法，涉及作物抗性育种技术领域，包括以下几个步骤：S1、菌丝悬浮液制备；S2、甘薯薯块打孔孢子液接种；S3、抗性评价；所述S1具体为：S1.1、病原菌分离和准备；S1.2、甘薯准备；所述S2具体为：S2.1、用灭菌打孔器在薯块赤道部位均匀刺出一定深度的伤口，并用移液枪接入20μL，1×106CFU的软腐病孢子悬浮液，以清水做对照；S2.2、待薯块上孢子悬浮液不再溢流后置于培养箱内。本发明将现有方法菌饼改为孢子液作为病源接种，孢子悬浮液制备培养时间短，制备简易、快速、量大且培养箱保存5天内致病力不变，有利于大规模鉴定，并且3‑5天统计发病情况更符合实际情况，较为科学。

技术研发人员：张静珍,陆国权
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15