一种三肽-1、蓝铜肽的合成方法及其应用与流程

本发明属于化妆品多肽原料的，更具体地，涉及一种三肽-1、蓝铜肽的合成方法及其应用。

背景技术：

1、蓝铜肽是gly-his-lys（ghk）三肽-1的铜络合物，最早于1973年从人血浆中分离得到。蓝铜肽最早被发现有修复伤口的作用，随着研究的深入，越来越多的功能被开发。作为一种信号肽，蓝铜肽可以作为组织重塑的激活剂，具有促进伤疤外部大量胶原蛋白集聚物的降解，皮肤正常胶原蛋白的合成，具有抗炎、抗氧化、提高肌肤弹性，减少皱纹等作用。

2、蓝铜肽的合成分成两个步骤，第一步是合成母肽（三肽-1），第二步是三肽-1和铜盐络合得到蓝铜肽，根据需要可以制备成醋酸盐或盐酸盐等。

3、国内对三肽-1和蓝铜肽的合成研究做了很多工作，以下列举了部分：

4、（1）“ghk和eptifibatide的合成研究，熊瑛，厦门大学”中介绍以gly、his和lys为起始原料，先合成boc-gly-oh、h-his(trt)-oh和h-lys(boc)-oh，再通过dcc-hobt缩法从n端到c端合成boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh，脱保护合成三肽-1的方法，从文中看出作者所得的产物纯度和收率都不高，无法进行产业化生产。

5、（2）专利cn103665102采用boc-gly-osu、his和boc2o，his boc保护得到boc-gly-his(boc)-oh，制备活性酯boc-gly-his(boc)-osu，再与h-lys(ac)-oh反应生成boc-gly-his(boc)-lys(ac)-oh，最后tfa脱boc和ac保护基得到三肽-1。这个方法是特别之处在于缩合，从具体工作中是比较难实现的，tfa脱乙酰基（ac）未见其它相关报道。

6、（3）专利cn107098950采用氯乙酰氯与组氨酸反应得到clch2co-his-oh，然后与三氟乙酸酐反应得到clch2co-his(tfaa)-oh，酰氯化得到clch2co-his(tfaa)-cl，再与h-lys(tfaa)-oh反应得到clch2co-his(tfaa)-lys(tfaa)-oh，最后通过氨水去三氟乙酰基的同时得胺基化得到三肽-1；三氟乙酰基（tfaa）保护的原料的成本较高，n端到c端合成的合成方法容易出现his手性异构的杂质。

7、（4）专利cn107778349采用trt-gly-oh、h-his(trt)和h-lys(trt)-oh通过活性酯缩合法，两次缩合得到trt-gly-his(trt)-lys(trt)-oh，最后醋酸全脱保护得到三肽-1；trt保护氨基本原成本高，原子经济性较差。

8、（5）专利cn111690037采用boc-gly-oh、h-his(trt)-oh/h-his(boc)-oh和h-lys(boc)-oh为原料通过活性酯缩合法合成boc-gly-his(trt)/his(boc)-lys(boc)-oh，再三氟乙酸脱保护得到三肽-1；采用的也是n端到c端合成合成方法，容易出现his手性异构的杂质。

9、（6）专利cn113045472以boc-gly-osu、h-his(trt)-oh、h-lys（boc)-oh为原料，先合成boc-gly-his(trt)-oh二肽（油状），再次制备活性酯与h-lys（boc)-oh反应得到boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh（固体），调ph7-8析出纯化，25%的tfa/dcm脱保护得到粗品三肽-1，通过离子交换柱除盐后得到三肽-1；与以上几种方法相比基本没有突出的改进，同样容易出现his手性异构的杂质。

10、（7）专利cn116143866采用可溶性载体固相合成法以boc-gly-oh、fmoc-his(trt)-oh和fmoc-lys(boc)-oh为原料合成boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh，脱保护得到三肽-1；与固相合成方法类似，成本较高，用什么样的载体没有公开。

11、（8）专利cn107778349公开了一种低成本合成ghk醋酸盐的方法，该方法将tit-gly-his(tit)-lys(trt)-oh在醋酸和三异丙基硅烷中脱保护，生成ghk醋酸盐的方法。该方法虽然可以降低生成ghk醋酸盐的成本，但是在合成ghk-cu中醋酸根离子过多，会导致ghk-cu无法析出。

12、（9）专利cn103665102公开了一种chk三肽的合成方法，该方法具体是合成boc-gly-his(boc)-lys(ac)-oh后用三氟乙酸脱掉保护，得到ghk的三氟乙酸盐，然后经反向色谱、离子交换色谱生成ghk醋酸盐。该方法的缺点是脱保护的三氟乙酸盐需要经反向色谱纯化除去产物中三氟乙酸，再经过离子交换色谱才能转换成醋酸盐，这种方法成本较高，且不适宜用于大规模生产。

13、上述报道的固相合成法、可溶性载体法和pickart等开发的cbz保护法采用的由c端向n端合成的方法，该类方法所得产物中的手性杂质较少，但固相合成法和可溶性载体法的合成成本过高，不利于工业化大规模生产；cbz保护法经过改进后，目前还有很有企业在使用，但有几个问题存在：1）要使用氢化特种设备；2）二肽脱boc时选择性差，会有少量cbz和his侧链保护基脱落造成后续反应杂质过多，纯化困难；3）在与cbz-gly-oh缩合时，中和后的h-his(cbz/trt)-lys(cbz)-obn容易产生二酮哌嗪副产物，导致收率下降；4）当his使用trt保护时需要额外的步骤去除保护基团，cbz-gly-his(trt)-lys(cbz)-obn溶解度差，纯化困难。其它由n端向c端合成的方法都没有考察his异构化情况，产物质量风险较高，有一些工艺使用的保护基兼容性不够或价格高，脱保护时大多使用毒性较高的三氟乙酸，产生的三废多，生产环境成本高。

14、因此，亟待开发出一种新的高产率、低成本、低污染、适合工业化生产的三肽-1或蓝铜肽合成方法。

技术实现思路

1、针对上述现有的技术问题，本发明提供了一种三肽-1的合成方法。所述合成方法对工艺进行整体优化，并采用“一锅法”完成多个步骤，不需要经过额外的纯化步骤即可获得满足产品纯度要求的三肽-1，有效缩短了生产时间和减少工业三废，所述合成方法具有高产率，低成本，符合节能减排要求和适合工业化生产的优点。

2、本发明的第二个目的在于提供一种三肽-1的合成方法制备获得的三肽-1。

3、本发明的第三个目的在于提供一种蓝铜肽。

4、本发明的第四个目的在于提供三肽-1或蓝铜肽在制备化妆品中的应用。

5、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

6、一种三肽-1的合成方法，包括以下步骤：

7、（1）以fmoc-his(trt)-oh为原料，加入反应物，在活化剂参与下反应制备活性酯fmoc-his(trt)-or1；所述反应物选自hosu、honb、hopht、2,4-二氯苯酚或五氟苯酚酯；

8、（2）活性酯fmoc-his(trt)-or1与h-lys(boc)-oh进行酰胺化反应合成fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh；

9、（3）fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh脱fmoc保护基得到h-his(trt)-lys(boc)-oh；

10、（4）h-his(trt)-lys(boc)-oh脱trt保护基得到h-his-lys(boc)-oh；

11、（5）h-his-lys(boc)-oh与boc-gly-or2活性酯进行酰胺化反应合成boc-gly-his-lys(boc)-oh；

12、（6）boc-gly-his-lys(boc)-oh脱boc保护基获得三肽-1；

13、其中，所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应，或所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应；

14、r1和r2对应的取代基选自：hosu、honb、hopht、2,4-二氯苯酚或五氟苯酚酯脱去羟基后对应的取代基；

15、所述合成方法的工艺线路如下：

16、。

17、进一步优选地，所述反应物选自hosu。

18、优选地，所述步骤（1）中，将fmoc-his(trt)-oh的溶液与反应物混合，搅拌，冷却，加入活化剂，制备获得活性酯fmoc-his(trt)-or1；所述活化剂选自dcc、edci或dic中的一种或多种。

19、优选地，所述步骤（1）中，fmoc-his(trt)-oh与反应物的摩尔比为1：（0.9～1.2）。

20、优选地，当所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应，所述步骤（2）至（4）为：

21、（2）h-lys(boc)-oh溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，降温，加入碱溶液，滴加fmoc-his(trt)-or1和碱溶液反应；

22、（3）将碱溶液加入步骤（2）所得反应液，ph控制在11～13，反应结束脱去fmoc保护基；

23、（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节ph值调整至2～3或将步骤（3）所得反应液萃取后水层用酸溶液调节ph值调整至2～3，并加热至70～90℃至反应结束，脱去trt保护基，后处理获得h-his-lys(boc)-oh。

24、在一些更为具体的实施方案中，当所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应，所述步骤（2）至（4）为：

25、（2）h-lys(boc)-oh溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，降温至10～20℃，加入碱溶液，调节ph为9～11，滴加fmoc-his(trt)-or1和碱溶液反应；

26、（3）将碱溶液加入步骤（2）所得反应液，ph控制在11～13，反应结束脱去fmoc保护基；

27、（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节ph值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，去除混合溶剂，降至室温，萃取除去trt保护基和芴烯，调ph至7～8，降温至5～10℃，获得h-his-lys(boc)-oh。

28、优选地，当所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应，此时，所述fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh分离纯化，所述步骤（3）至（4）为：

29、（3）fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，加入碱溶液，ph控制在11～13，反应结束脱去fmoc保护基；

30、（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节ph值调整至2～3或将步骤（3）所得反应液萃取后水层用酸溶液调节ph值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，脱去trt保护基，后处理获得h-his-lys(boc)-oh。

31、在一些更为具体的实施方案中，当所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应，此时所述fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh分离纯化，所述步骤（2）以及步骤（3）至（4）为：

32、（2）h-lys(boc)-oh溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，降温至10～20℃，加入碱溶液，调节ph为9～11，滴加fmoc-his(trt)-or1和碱溶液反应，反应结束后采用酸溶液调节ph至2～3，萃取，浓缩，获得粗产物fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh；

33、（3）fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，加入碱溶液，ph控制在11～13，反应结束脱去fmoc保护基；

34、（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节ph值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，去除混合溶剂，降至室温，萃取除去fmoc和trt保护基脱落产生的副产物，调ph至7～8，降温至5～10℃，获得h-his-lys(boc)-oh。

35、优选地，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。进一步优选地，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液。

36、优选地，所述酸溶液选自醋酸、柠檬酸、抗坏血酸、盐酸、硫酸或磷酸中的一种或多种。进一步优选地，所述酸溶液选自盐酸。

37、进一步地，在上述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法进行反应或在上述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法进行反应时，所述步骤（3）生成的h-his(trt)-lys(boc)-oh二肽无需分离纯化，不存在二酮哌嗪生成风险，可以通过萃取除去芴烯。

38、优选地，所述步骤（4）中，反应结束后，进行结晶处理获得h-his-lys(boc)-oh。

39、进一步优选地，所述结晶处理包括：反应结束后反应液除去反应中使用的与水互溶的有机溶剂，并用溶剂萃取除去杂质，所得水溶液用碱调ph至7～8，降温至5～10℃，析出h-his-lys(boc)-oh。

40、优选地，所述步骤（5）中，h-his-lys(boc)-oh与boc-gly-or2活性酯进行酰胺化反应，合成boc保护基保护的boc-gly-his-lys(boc)-oh，随后调节ph至2～3析出。

41、在一些更为具体的实施方案中，所述步骤（5）中，h-his-lys(boc)-oh分散于水和四氢呋喃，加入碱溶液，并调ph 9～10溶解，温度维持5～10℃，加入boc-gly-or2活性酯进行酰胺化反应，反应结束后去除溶剂，调节ph为2～3，萃取，降温，析晶，获得boc保护基保护的boc-gly-his-lys(boc)-oh。

42、优选地，所述步骤（6）中，boc保护基保护的boc-gly-his-lys(boc)-oh采用盐酸的醚溶液或酯溶液脱去boc保护基，得到三肽-1。

43、进一步优选地，所述盐酸的醚溶液为盐酸的四氢呋喃溶液。当采用盐酸的醚溶液或酯溶液脱去boc保护基时，制备获得的三肽-1为三肽-1的盐酸盐。

44、进一步地，本发明请求保护上述三肽-1的合成方法制备获得的三肽-1。

45、进一步地，本发明请求保护一种蓝铜肽，上述三肽-1中加入铜盐，络合结晶得到蓝铜肽。更具体地，将上述三肽-1溶于水中，加入铜盐，络合结晶得到蓝铜肽。

46、进一步地，本发明请求保护上述三肽-1或上述蓝铜肽在制备化妆品中的应用。更具体地，所述化妆品包括但不限于爽肤水、乳液、精华、霜、膏、面膜或冻干粉等。

47、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

48、（1）本发明提供了一种新的“一锅法”合成三肽-1以及蓝铜肽的工艺路线，并且合成了2种新的中间体化合物h-his-lys(boc)-oh和boc-gly-his-lys(boc)-oh。采用本发明“一锅法”的工艺制备获得的三肽-1的收率>90%，远高于每一步都进行纯化操作的收率70%，本技术的工艺更简洁，收率更高，更适合于工业化生产。

49、（2）本发明使用的fmoc-his(trt)-oh、h-lys(boc)-oh和boc-gly-oh都是常用原料，价格低且容易获得，在反应中依次脱去fmoc和trt，终产物前的保护肽boc-gly-his-lys(boc)-oh仅含有一种保护基boc，因此脱保护时所用的条件一致。

50、（3）本发明中，boc-gly-his-lys(boc)-oh经过盐酸的醚溶液或酯溶液脱去后即得到三肽-1盐酸盐，反应过程中避免使用毒性较高的三氟乙酸以及难结晶的醋酸来脱保护基，产物纯度更高，无需反向色谱、离子交换色谱去除三氟乙酸等，且不需要经过转盐即可与铜盐络合制备高纯度的蓝铜肽，极大的降低生产成本，适合于大规模生产。

51、（4）本发明的肽链构建使用两次活性酯缩合，分别为fmoc-his(trt)-oh和boc-gly-oh的活性酯。本法制备过程能很好的保持his的手性，最终产物经lcms分析没有同分异构体，氨基酸分析显示his手性异构低于0.3%，在分析方法的误差范围，可认定基本没有手性异构杂质。

52、（5）本发明中，fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh合成h-his-lys(boc)-oh的过程中通过调控ph依次脱去fmoc和trt保护基。脱去fmoc和trt保护基可以降低反应位阻，使boc-gly-or2活性酯的缩合时间更短，产物纯度更高；另一方面便于h-his-lys(boc)-oh保护二肽的纯化。

53、（6）本发明发现h-his(trt)-lys(boc)-oh在水中析出的纯度远低于h-his-lys(boc)-oh。前一步未反应完全的fmoc-his(trt)-oh带来的h-his(trt)-oh是主要杂质，即使再次结晶也很难除去，继续反应生成gly-his杂质会影响最终产物的纯度。本发明在一锅反应中调节ph依次脱去fmoc和trt，通过在合成h-his-lys(boc)-oh反应釜内调ph至11～13脱去fmoc，调ph 2～3并加热至70～90℃反应脱去trt，反应结束后，调ph至7～8，沉析结晶得到高纯度h-his-lys(boc)-oh二肽中间体，以fmoc-his(trt)-oh投料计算，收率大于95%。

54、（7）在整个合成过程中，中间体h-his-lys(boc)-oh的结晶纯化效果最好，并且在使用纯化后的h-his-lys(boc)-oh进行后续反应时基本没有产生杂质，不需要经过额外的纯化步骤即可获得满足产品纯度要求的三肽-1盐酸盐。经过工序的组合优化，充分利用“一锅法”，步骤（2）至步骤（4）过程的中间体fmoc-his(trt)-lys(boc)-oh和h-his(trt)-lys(boc)-oh不需要进行分离提纯，有效缩短生产时间和减少工业三废，是一个低成本，符合节能减排要求，适合工业化生产的工艺。