一种合成非天然α-氨基酸的氧化葡萄糖酸杆菌及其应用

本发明涉及一种合成非天然α-氨基酸的氧化葡萄糖酸杆菌及其应用，属于基因工程和全细胞催化。

背景技术：

1、非天然α-氨基酸具有易于功能化的氨基和羧基基团，是化学合成和制药中广泛存在且极具价值的手性构建模块。其中，l-苯甘氨酸是包括青霉素和普那霉素在内的β-内酰胺类抗生素的关键前体，l-2-氨基丁酸是手性药物布拉西坦和乙胺丁醇的关键前体，l-正亮氨酸和l-高烯丙基甘氨酸已应用于蛋白修饰和功能肽的合成，l-正缬氨酸是治疗高血压药物培哚普利的关键中间体。目前，非天然α-氨基酸的合成主要有化学合成法和生物转化法，其中，化学合成法需要有毒催化剂的参与，环境污染严重的同时反应条件苛刻、立体选择性差。而生物转化法绿色环保，副产物少，选择性高，是现代可持续化学工业的一种有前途的合成策略。

2、现有技术中，通过生物转化法催化合成非天然氨基酸的报道中，底物为芳香族环氧化物，产物也均为芳香族非天然α-氨基酸。例如，李智等(nature communications,2016.doi:10.1038/ncomms11917)报道的以过表达了苯乙烯单加氧酶、环氧化物水解酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、羟基酸氧化酶、转氨酶，以及用于构建辅酶循环的过氧化氢酶和谷氨酸脱氢酶的大肠杆菌重组菌株为宿主，以苯乙烯及其衍生物为底物，催化合成非天然氨基酸的反应中，产物均为芳香族非天然氨基酸l-苯甘氨酸及其衍生物。目前，还没有生物转化法既能以芳香族或脂肪族的环氧化物为底物，又能以1,2-二醇作为底物，来生产非天然α-氨基酸。

技术实现思路

1、技术问题：

2、本发明要解决的技术问题是现有技术中生物转化法生产均为芳香族非天然α-氨基酸，尚无生物转化法既能以芳香族或脂肪族的环氧化物为底物，又能以1,2-二醇作为底物，来生产非天然α-氨基酸。

3、技术方案：

4、为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

5、本发明提供了一种合成非天然α-氨基酸的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，所述氧化葡萄糖酸杆菌过表达了亮氨酸脱氢酶bcldh和扁桃酸脱氢酶lbmdh，和/或环氧化物水解酶speh。

6、在本发明的一种实施方式中，所述非天然α-氨基酸包括l-苯甘氨酸、l-α-氨基丁酸、l-正缬氨酸、l-正亮氨酸、l-高烯丙基甘氨酸。

7、在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌包括氧化葡萄糖酸杆菌sta。

8、在本发明的一种实施方式中，所述非天然α-氨基酸包括l-苯甘氨酸、l-2-氨基丁酸、l-正缬氨酸、l-正亮氨酸或l-高烯丙基甘氨酸。

9、在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶bcldh来源于蜡样芽孢杆菌，bcldh酶的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。

10、在本发明的一种实施方式中，所述扁桃酸脱氢酶lbmdh来源于短乳杆菌，lbmdh酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

11、在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶speh来源于鞘氨醇单胞菌，speh酶的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

12、在本发明的一种实施方式中，所述过表达的载体包括质粒pbbr1mcs-2。

13、在本发明的一种实施方式中，以启动子p04750进行亮氨酸脱氢酶bcldh的表达，启动子p04750的核苷酸序列如seq id no.5所示。

14、在本发明的一种实施方式中，以启动子plac进行扁桃酸脱氢酶lbmdh的表达。

15、在本发明的一种实施方式中，以启动子p12780进行环氧化物水解酶speh的表达，启动子p12780的核苷酸序列如seq id no.4所示。

16、本发明还提供了一种合成非天然α-氨基酸的方法，所述方法为，将上述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌添加至含有1,2-二醇或环氧化物的反应体系中进行反应，制备得到非天然α-氨基酸。

17、在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的添加量为细胞干重10-15g/l，优选为12g/l。

18、在本发明的一种实施方式中，所述1,2-二醇或环氧化物的浓度为80-100mm。

19、在本发明的一种实施方式中，所述1,2-二醇包括：1-苯基-1,2-乙二醇、1,2-丁二醇、1,2-戊二醇或1,2-己二醇。

20、在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物包括：环氧苯乙烷、1,2-环氧丁烷、1,2-环氧戊烷、1,2-环氧己烷或1,2-环氧-5-己烯。

21、在本发明的一种实施方式中，所述反应包括两阶段ph调控步骤，第一阶段为催化1,2-二醇或环氧化物合成α-羟基酸，第二阶段为催化α-羟基酸合成α-氨基酸；所述第一阶段初始ph为6.0-8.0，优选为7.0；所述第二阶段初始ph为8.0-10.0，优选为9.5。

22、在本发明的一种实施方式中，所述两阶段ph调控中第一阶段所用缓冲液为100-300mm的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pb缓冲液)，优选为200mm。

23、在本发明的一种实施方式中，所述两阶段ph调控中第一阶段反应结束后加入100-300mm的nh4cl，并使用浓氨水调节反应液ph，nh4cl浓度优选为200mm。

24、在本发明的一种实施方式中，反应条件为：25-35℃，100-300rpm，反应16～24小时。

25、优选的，反应条件为：30℃，220rpm，反应16～24小时。

26、本发明还提供了上述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，或上述合成非天然α-氨基酸的方法在制备非天然α-氨基酸和/或含有非天然α-氨基酸的产品中的应用。

27、有益效果：

28、(1)本发明通过将环氧化物水解酶、扁桃酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶在氧化葡萄糖酸杆菌中表达，成功构建了以1,2-二醇或环氧化物为底物合成非天然α-氨基酸催化菌株。

29、(2)本发明所构建的菌株以1,2-二醇为底物时，d-1-苯基-1,2-乙二醇、rac-1-苯基-1,2-乙二醇、d-1,2-丁二醇、rac-1,2-丁二醇、rac-1,2-戊二醇、rac-1,2-己二醇的转化率分别为78％、40％、74％、36％、41％、38％，产量分别为：11.8g/l(l-苯甘氨酸)、6.0g/l(l-苯甘氨酸)、7.6g/l(l-α-氨基丁酸)、3.7g/l(l-α-氨基丁酸)、4.8g/l(l-正缬氨酸)、5.0g/l(l-正缬氨酸)。

30、(3)本发明所构建的菌株以环氧化物为底物时，d-环氧苯乙烷、rac-环氧苯乙烷、d-1,2-环氧丁烷、rac-1,2-环氧丁烷、rac-1,2-环氧戊烷、rac-1,2-环氧己烷和rac-1,2-环氧-5-己烯的转化率分别为84％、39％、72％、32％、36％、38％、42％，产量分别为：10.2g/l(l-苯甘氨酸)、4.7g/l(l-苯甘氨酸)、7.4g/l(l-α-氨基丁酸)、3.3g/l(l-α-氨基丁酸)、4.2g/l(l-正缬氨酸)、5.0g/l(l-正缬氨酸)、5.4g/l(l-高烯丙基甘氨酸)。